虎黄烧伤凝胶剂的制备及质量控制

2015-03-13杨君张洪魏丹芸

中国医药导报 2015年6期

杨君张洪魏丹芸

[摘要] 目的确定虎黄烧伤凝胶剂的制备工艺并建立其质量控制的方法。方法通过单因素实验以凝胶剂的成型性和稳定性为考察指标，筛选出最适宜的载药基质。采用高效液相色谱法同时测定该制剂中虎杖苷和盐酸小檗碱的含量。结果虎黄烧伤凝胶剂的最佳基质材料为2.5%的羟丙甲基纤维素；虎杖苷质量浓度与峰面积的线性回归方程为Y=79 415X-444 889（r=0.9994），线性范围为15.6～78.0 μg/mL；盐酸小檗碱质量浓度与峰面积的线性回归方程为Y=65 576X-583 154（r=0.9996），线性范围为34.75～173.75 μg/mL；平均加样回收率分别为99.34%、99.64%（n=6）。结论本研究制剂制备工艺简单，性质稳定，含量测定方法准确可靠，重现性好，促进了该制剂在临床上的应用。

[关键词] 虎黄烧伤凝胶剂；制备；质量控制；高效液相色谱法

[中图分类号] R283.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（c）-0082-05

虎黄烧伤凝胶是一种用于治疗皮肤热损伤的中药制剂，其依据中医理论清热解毒、活血化瘀、通络、收敛、去腐生肌的组方原则，筛选出以虎杖和黄连等2味药材为处方并结合现代药剂学方法研制而成。一直以来，武汉大学人民医院自制制剂——烧伤酊，是将虎杖和黄连饮片用适量的乙醇浸泡、压滤，待澄清后封装而成，该药在临床上用于烧烫伤的治疗效果明显，但酊剂易挥发，稳定性差，易产生皮肤刺激，影响使用效果。而凝胶剂在这些方面却具有明显的优势，不仅具有良好的生物相容性，且易于涂布使用，局部给药后易吸收、稳定性较好[1]，凝胶涂抹层可防止外来刺激和预防细菌感染，为创面组织的修复和再生提供有利环境[2]。本实验根据临床需要对常用酊剂进行剂型改良研究，确定了虎黄烧伤凝胶剂的制备工艺，并建立了以高效液相色谱（HPLC）法同时测定该制剂中虎杖苷和盐酸小檗碱含量的质量控制方法，该方法简便易行，结果准确，可作为该制剂质量控制的指标。

1 仪器与试药

1.1 仪器

分析电子天平；紫外分光光度仪（岛津UV-1800）；高效液相色谱仪（岛津LC-20AT）；SPD-20A紫外检测器；Agilent Extend-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；精密恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂）；超声波清洗器（SK5200H，上海科导超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（H-1600RW，武汉世纪超杰实验仪器有限公司）。

1.2 试药

虎杖苷标准品（中国食品药品检定研究院，批号：111575-200502）；盐酸小檗碱标准品（中国食品药品检定研究院，批号：110713-201212）；虎杖（湖北天济中药饮片有限公司，批号：20131201）；黄连（湖北天济中药饮片有限公司，批号：20131253）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，Tedia company）；乙腈（色谱纯，Tedia company）；三乙醇胺（AR，国药集团化学试剂有限公司）；甘油（AR，国药集团化学试剂有限公司）；水为实验室自制纯化水。

凝胶药用辅料均为药用级别，卡波姆940、卡波姆943、卡波姆974、壳聚糖、羟丙甲基纤维素（HPMC-K4M）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）均购于北京化学试剂公司。

2 方法与结果

2.1 虎杖-黄连提取液的制备

参考有关虎杖和黄连提取研究的文献[3-7]设计L9（34）正交实验，以乙醇浓度、提取温度、提取次数和料液比为可变因素，考察其不同水平对有效成分虎杖苷和盐酸小檗碱的提取率（通过HPLC测得）影响。根据大量文献资料及预实验结果，采取以下方法制备虎杖-黄连提取液可使虎杖苷和盐酸小檗碱有较高的提取率：分别取处方量虎杖粗粉15 g和黄连粗粉10 g，用65%乙醇在70℃水浴回流提取3次，每次1.5 h，料液比为1∶10（g/mL），趁热过滤，合并提取液，60℃减压浓缩至无醇味，用蒸馏水调至一定体积，滤过，备用。

2.2 虎黄凝胶制备工艺研究

2.2.1 基质载药实验根据预实验，选取卡波姆940、卡波姆934、卡波姆947、壳聚糖、HPMC-K4M和CMC-Na为基质，分别于适量纯化水中溶胀溶解，制备空白凝胶。将虎杖-黄连提取液预热至50℃，缓慢加入空白凝胶，边加边搅拌，观察药物凝胶的成型性，结果见表1。

卡波姆对盐类敏感[8-9]，而药物提取浓缩液中含有的盐酸小檗碱为季铵盐，为其凝胶浑浊原因之一。壳聚糖载药能力差，容易产生水化现象。因此舍弃卡波姆和壳聚糖，根据表1结果对HPMC-K4M和CMC-Na作进一步考察。

2.2.2 稳定性考察根据“2.2.1”项下结果，以HPMC-K4M和CMC-Na为载药基质制备药物凝胶，在凝胶中加入润湿剂甘油10%，防腐剂山梨酸钾0.2%，观察凝胶剂在不同条件下的稳定性，结果见表2。

表2 不同基质形成凝胶剂的稳定性考察

注：HPMC-K4M：羟丙甲基纤维素；CMC-Na：羧甲基纤维素钠

根据表2结果，确定选用HPMC-K4M作为虎黄烧伤凝胶剂的载药辅料。

2.2.3 虎黄烧伤凝胶剂中HPMC-K4M用量优选以HPMC-K4M为载药辅料制备不同HPMC-K4M含量的虎黄烧伤凝胶，根据凝胶的成型性、涂展性和稳定性进一步确定HPMC的最佳用量，结果见表3。

表3 虎黄烧伤凝胶剂中HPMC-K4M用量优选

注：HPMC-K4M：羟丙甲基纤维素

由表3确定虎黄烧伤凝胶剂中HPMC-K4M的最佳用量为2.5%。

2.3 虎黄烧伤凝胶剂的制备

根据原有处方的药物比例和上述凝胶剂成型工艺的研究结果，确定虎黄烧伤凝胶剂的制备方法如下：分别称取虎杖粗粉15 g、黄连粗粉10 g，按照“2.1”项下方法制备虎杖-黄连提取液（约300 mL），加山梨酸钾1 g使溶解，得相Ⅰ；取HPMC-K4M 12.5 g，加甘油50 g混合均匀，加适量纯化水溶胀溶解，静置过夜，得相Ⅱ。将相Ⅰ预热至50℃并缓慢加入相Ⅱ，搅拌均匀，最后补足蒸馏水至500 g，搅拌均匀至冷却，得虎黄烧伤凝胶。

3 质量控制

3.1 性状

本制剂为质地细腻，均匀的黄褐色半透明半固体凝胶。

3.2 检查

取本品2 g，加20 mL纯化水搅拌至溶解后测定pH，pH值应为6～7。其他检查均符合《中国药典》2010年版二部凝胶剂项下有关的各项规定[10]。

3.3 稳定性试验

3.3.1 离心稳定性取3份10 g的样品分别装入规格为10 mL（外径为15.5 mm）离心管中，以3000 r/min离心30 min，凝胶无分层现象。

3.3.2 耐热耐寒试验各取3份10 g装入离心管中的样品，分别放入50℃烘箱恒温12 h及冰箱中-20℃冷冻12 h，凝胶无分层，且恢复至常温后无分层，无颜色变化。

3.4 皮肤刺激性试验

取12只豚鼠，雌雄各半，体重均约为300 g，分为两组，一组设为破损皮肤组，另一组设为完整皮肤组。均剃去豚鼠脊柱两侧鼠毛，两侧脱毛面积各为4 cm×4 cm。对破损皮肤组豚鼠脱毛处采用灭菌针尖划伤处理，以见有血液渗出为度，两侧处理伤口损伤程度相当。24 h后给两组所有豚鼠脊柱右侧涂抹自制虎黄烧伤凝胶剂，给左侧涂抹不含药物的空白基质凝胶，豚鼠无尖叫、屈身、逃逸等现象，6 h后用棉签蘸温水温和除去豚鼠皮肤上的凝胶层，观察皮肤均无明显红斑和水肿，豚鼠活动表现正常。

3.5 含量测定

3.5.1 色谱条件色谱柱：Agilent Extend-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.05 mol/L的磷酸二氢钾（磷酸调节pH至4.2），梯度洗脱程序：0 min（76%B）→6 min（76%B）→12 min（70%B）→15 min（40%B）→16 min（40%B）→25 min（76%B）；检测波长为324 nm；流速为1.00 mL/min；柱温为30℃；进样量为20 μL。在此色谱条件下样品各组分分离良好，虎杖苷及盐酸小檗碱与相邻未知色谱峰的分离度不低于1.6，理论塔板数以盐酸小檗碱计不低于5000。对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液的色谱图见图1。

时间（min）

A.对照品溶液；B.阴性对照溶液；C.供试品溶液；1.虎杖苷；2.盐酸小檗碱

图1 各溶液高效液相色谱图

3.5.2 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的虎杖苷对照品3.12 mg，盐酸小檗碱对照品6.95 mg，置于10 mL棕色容量瓶中。加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为312 μg/mL虎杖苷和695 μg/mL盐酸小檗碱的混合对照品溶液。

3.5.3 供试品溶液的制备精密称定按“2.3”项下方法配制而成的凝胶2.03 g，置于一个10 mL（外径为15.5 mm）圆底连盖离心管中，加入适量甲醇，超声15 min后在高速离心机中以15 000 r/min离心10 min，取上清加入25 mL容量瓶中，重复此步骤3次，收集3次所得上清液，补足甲醇至刻度，摇匀，取适量用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

3.5.4 阴性对照溶液制备按照处方组成，依次加入除虎杖-黄连混合提取液的其他材料制备空白基质凝胶，并按照“3.5.3”项下制备供试品溶液的方法制备阴性对照品溶液。

3.5.5 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取适量过0.45 μm滤膜，然后依次进样。以溶液浓度X（μg/mL）为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。虎杖苷的回归方程为：Y=79 415X-444 889，r=0.9994，线性范围为15.6～78.0 μg/mL；盐酸小檗碱的回归方程为：Y=65 576X-583 154，r=0.9996，线性范围为34.75～173.75 μg/mL。

3.5.6 精密度实验取上述对照品溶液，分别在同日内连续进样5次，测定峰面积，计算日内精密度。结果虎杖苷和盐酸小檗碱的RSD分别为1.61%和1.66%。在5日内连续进样5次，测定峰面积，计算日间精密度，结果虎杖苷和盐酸小檗碱的RSD分别为2.13%和2.37%，表明仪器精密度良好。

3.5.7 重现性实验取同一份凝胶制剂，按供试品溶液的制备方法制得6份，在上述色谱条件下测定。结果虎杖苷的平均含量为52.73 μg/mL，RSD为0.76%（n=6）；盐酸小檗碱的平均含量为97.64 μg/mL，RSD为1.09%（n=6），表明方法重现性良好。

3.5.8 稳定性试验取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样测定，结果表明虎杖苷和盐酸小檗碱在8 h内基本稳定，虎杖苷RSD为1.3%，盐酸小檗碱RSD为0.47%，说明样品在8 h内稳定。

3.5.9 加样回收率实验从已知含量的同一批虎黄烧伤凝胶中精密称取6份约1 g的样品，分别精密加入高、中、低不同浓度的对照品溶液，按“3.5.3”项下方法制备供试品溶液，并分别在“3.5.1”项下的色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

3.5.10 样品含量测定从3份相同制备方法不同批次制备的虎黄烧伤凝胶中取样，按“3.5.3”项下方法制备供试品溶液，参照“3.5.1”项下色谱条件分别进样测定含量并折算成每克虎黄烧伤凝胶中虎杖苷和盐酸小檗碱的含量，结果见表2。

4 讨论

制备凝胶剂，首先得选择合适的载药基质。本实验在选择凝胶基质时，对常用高分子材料进行考察，发现CMC-Na和HPMC均比较适合作此载药材料，但因最终药用制剂需加入一定量的防腐剂山梨酸钾，而加入山梨酸钾后HPMC稳定性更佳，所以选择HPMC。由HPMC制备而成的凝胶细腻均匀，释药快，与皮肤黏附贴合效果好，能吸收患处的组织渗出液，且具有一定的成膜性[11]，保护创面组织，非常适合此凝胶制备。

虎杖苷和盐酸小檗碱在热水中的溶解度均大于其在冷水中的溶解度，但在过热的环境下盐酸小檗碱不稳定[12]，因此在凝胶制备过程中将虎杖-黄连提取液加热到50℃使药物活性成分充分溶解分散再加入空白基质，形成的药物凝胶更加均匀。

虎黄烧伤凝胶中主要活性物质为虎杖苷和盐酸小檗碱，因此二者的含量是该制剂质量控制及临床疗效的关键。本实验通过文献[10，13]考察并结合对色谱条件的实际摸索，建立HPLC法同时测定虎杖苷和盐酸小檗碱含量的方法，提高了该制剂的质量标准。由于两种物质的最大吸收波长不同，因此分别对虎杖苷和盐酸小檗碱的标准品甲醇溶液进行全波长扫描，选取几个二者均有较大吸收的波长，如296、307、345、324 nm，在上述色谱条件下对供试品进行分析，结果显示在324 nm处所得HPLC图谱各峰分离效果好，杂质干扰少，也较好地兼顾了峰形。

随着近些年来中药现代化的发展，中药制剂在烧烫伤的治疗中显示出其不可替代的重要性[14]。本实验将传统中药结合应用新型高分子材料制备成现代凝胶剂，并建立可行的质量控制方法，为虎黄烧伤凝胶的制备及质量控制提供了方法依据，为该制剂的临床应用提供了质量保证。

[参考文献]

[1] 卢丰.浅谈凝胶剂在中药制剂中的研究进展[J].中国中医药现代远程教育，2012，10（17）：162-164.

[2] 袁汀，周瑜姝.外用中药治疗烧烫伤的研究进展[J].光明中医，2010，25（11）：2151-2153.

[3] 仲珊珊，张颖，杨肖斌.黄连提取工艺的研究[J].内蒙古中医药，2013，33（2）：34-65.

[4] 李航，李小芳，李娜，等.星点设计一效应面法优化黄连提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（14）：52-55.

[5] 张建军，付建武，徐峻.星点设计-效应面法优选虎杖提取工艺[J].中国医院药学杂志，2012，32（6）：401-405.

[6] 王昌瑞，徐溢，张子春，等.虎杖的提取分离和纯化技术研究新进展[J].中成药，2012，34（2）：335-339.

[7] 黄传峻，李其兰，高申蓉.正交试验优选黄连提取工艺[J].中国药师，2005，8（8）：699-700.

[8] 郭红叶，伊博文，闫小平，等.新型辅料卡波姆在凝胶剂中应用现状[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（17）：371-374.

[9] 卢文芸，邹豪，蒋雪涛.生物黏附凝胶剂的研究与开发[J].药学进展，2003，27（2）：66-68.

[10] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010：907-908，附录19.