肺痨灵合剂的制备工艺研究

2015-03-13张娜娜徐文峥朱建丽

中国医药导报 2015年6期

张娜娜徐文峥朱建丽

[摘要] 目的优选肺痨灵合剂的制备工艺。方法根据处方中药材性质的不同，以挥发油提取量为指标，采取水蒸气蒸馏法提取山腊梅；以黄芪甲苷含量为检测指标，通过L9（34）正交实验设计及单因素试验考察，优选其他药材水提取工艺；然后再用乙醇沉淀法除杂，最后采用热处理溶解、吐温-80增溶即得。结果肺痨灵合剂最佳制备工艺为加入5倍处方量水，提取煎煮2次，每次2 h，乙醇醇沉体积分数为60%，热处理时间为20 min，采用1.5%样品量吐温-80进行挥发油增溶。结论优选的肺痨灵合剂制备工艺稳定可行，重复性好，为肺痨灵合剂的开发提供参考。

[关键词] 肺痨灵合剂；黄芪甲苷；正交试验；澄清度

[中图分类号] R283.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（c）-0078-04

肺结核，中医称为“肺痨”，是当今世界传染病中的主要杀手，我国结核病年发病人数占全球发病人数比例为14.3%，位居世界第2位[1]，近年来其发病率不

断上升，严重危害到人们的身体健康，同时给公共卫生问题带来新的困难和挑战[2-3]。目前肺结核已成为我国重点控制的传染病，多地指定了肺结核定点治疗医院。现阶段肺结核的治疗主要以化学药物为主，化学药物可以使结核病灶纤维化和钙化，进而达到痊愈的效果。但该抗结核化疗过程较长，且需要联合用药，药物蓄积较多，产生各种各样毒副反应，增加了患者的痛苦[4-6]。同时结核杆菌将机体蛋白用于自身代谢，致使机体负氮平衡，营养代谢紊乱，抵抗力低下。中医药治疗肺结核注重扶助正气，提高人体抵抗力，亦能降低化学药物的毒副作用，提高患者依从性，使患者顺利完成全程治疗，因此中医药防治肺结核越来越受到人们的重视并得到广泛研究。

肺痨灵合剂为浙江省丽水市中医院（以下简称“我院”）自主研发口服中药制剂，该方主要由黄芪、黄精、百部、白及、山腊梅等多味中草药组成，具有滋阴润肺、健脾补肾、扶正固本之功效。前期临床试验中发现：该合剂联合常规西药辅助治疗初治肺结核，临床治愈疗效和显效方面得到显著改善；严重胃肠道反应、肝功能损害及白细胞减少等副作用的发生率显著降低，T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均有不同程度的上升，CD8+、白介素（IL）-1及IL-6水平均有不同程度下降，表明肺痨灵合剂能够提高机体免疫功能。

前期临床试验中，肺痨灵合剂的制备方法为加入4倍处方量的水，浸泡0.5 h，采用全自动煎药机煎煮1 h。为促进该方更好、更广泛地用于临床，本文对其制备工艺进行了研究。根据处方中草药药效成分的性质及前期预试验结果，拟订该制剂的制备工艺路线为山腊梅采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，水提醇沉提取其他味中药材，最后将提取物配液混合，采用L9（34）正交试验优选肺痨灵合剂提取工艺，为该制剂的进一步研究打下基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）：Alltech2000 ES蒸发光散射检测器（美国奥泰科技<中国>有限公司），Sartorius BS 124S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.2 试剂与试药

黄芪甲苷对照品（批号：110781-200613）由中国药品生物制品检定所提供，黄芪、五味子、麦冬、百部等中药饮片均购于杭州桐君堂医药药材有限公司，经我院制剂室林娜副主任中药师鉴定为正品，符合《中国药典》2010年版一部[7]规定。乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水（自制），其余试剂为分析纯，吐温-80为药用规格。

2 方法与结果

根据处方中药材的性质，山腊梅主要含有要含有1，8-桉油素（1，8-cineole）、桧烯（sabinene）、β-蒎烯等挥发油成分[8-9]，其中桉油素含量最大，采用水蒸气蒸馏法提取。黄芪、黄芩、百合、黄精等其他味药材主要药效成分为皂苷、黄酮及其苷、糖、酸、生物碱等，均易溶于水[10-23]，故采用水煎煮法提取。

2.1 山腊梅挥发油提取工艺优选

在前期预试验基础上，取处方量的山腊梅碎叶片，加入6倍处方量的水，浸泡6 h，待药材充分浸透后，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，分别读取1～7 h挥发油提取量，记录结果分别为2.05、2.60、3.05、3.45、3.60、3.65、3.65 mL。该提取记录结果提示：6、7 h挥发油提取量最大，但4 h后挥发油已基本提取完全，为节约时间和能源，选定挥发油提取时间为4 h。分别称取3份同批次1个处方量的山腊梅碎叶片，按照文中确定的工艺路线提取挥发油，分别记录挥发油提取量，结果提取量平均为3.38 mL，与优选的工艺提取结果接近，表明优选的提取工艺稳定可行。

2.2 水提取工艺优选

2.2.1 水提取工艺正交试验设计

以黄芪甲苷含量为检测指标，选择L9（34）正交试验表，对煎煮时间、提取次数、加水量进行考察，因素与水平见表1。

表1 水提取工艺正交试验因素水平

2.2.2 黄芪甲苷的含量测定

2.2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；乙腈-水（33∶67）为流动相；柱温30℃；流速1.0 mL/min；进样量：10 μL；ELSD参数：漂移管温度101℃，气体流速2.7 L/min，氮气（纯度99.9%）压力25 Pa；按照检测指标黄芪甲苷计算，理论塔板数不低于4000。

2.2.2.2 黄芪甲苷对照品溶液的制备称取黄芪甲苷对照品适量，用微量分析天平精密称定，置于容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制备成每1毫升含1 mg黄芪甲苷的溶液，即得，作为对照品溶液[7]。

2.2.2.3 供试品溶液的制备精密量取肺痨灵合剂样品30 mL，置于250 mL分液漏斗中，分别加入60、40、40、40 mL水饱和正丁醇溶液振摇提取，合并下层正丁醇溶液，然后用40 mL氨试液洗涤2次，丢弃氨试液层，减压回收正丁醇溶液，得暗黄色残渣，加入10 mL蒸馏水使残渣溶解，放冷，将样品溶液过D101大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），先用重蒸水50 mL洗脱，水层弃去；继用 40%乙醇溶液50 mL洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，最后用70%乙醇溶液100 mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压浓缩至干，残渣用少量甲醇溶解并移置5 mL的容量瓶中，然后加甲醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液[7]。

2.2.3 水提取工艺正交试验结果

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按“2.2.2.1”项下色谱条件进行测定，具体结果见表2。

从表2水提取工艺正交试验结果可以看出，影响黄芪甲苷提取率的各因素主次为A（煎煮时间）>C（加水量）>B提取次数，其中煎煮时间的影响最为显著，其次是加水量，提取次数的影响最小，水提取最佳工艺为A3B2C3，即加入6倍处方量的水，煎煮提取2次，每次2 h。表3正交试验结果方差分析中数据显示煎煮时间影响显著，而加水量及提取次数的影响无显著性差异，综合考虑耗时耗能，故确定最佳水提工艺为A3B2C2，即加入5倍处方量水，煎煮提取2次，每次2 h。

2.2.4 水提取工艺试验验证

分别称取3份同批次1个处方量药材（共940 g），按照上述选择的优选工艺（加入5倍处方量水，煎煮提取2次，每次2 h）煎煮中药材，测定样品黄芪甲苷含量，黄芪甲苷提取率分别为53.43%、54.04%、53.78%，3次黄芪甲苷提取率平均值为53.75%，表明优选的水提取工艺稳定可重复。

2.3 醇沉工艺优选

中药材制备提取过程中常常利用醇沉的方法来去除杂质。一般情况下醇沉浓度越高，越有利于去除杂质，但杂质去除的同时也会带走部分有效成分，导致有效成分含量下降。为了既保证最大限度除去杂质，同时又尽量减少有效活性成分的损失，对不同浓度乙醇的醇沉效果进行了比较研究，分别选择体积分数为60%、70%、80%、90%的乙醇进行试验，测定醇沉后黄芪甲苷的含量[20-24]。

分别称取同批次处方量药材3份，加入5倍处方量的水，煎煮提取2次，每次2 h，煎煮完成后合并水煎煮液，然后将水提取液减压浓缩至适量，放冷至室温后，分别加入体积分数为60%、70%、80%、90%的乙醇进行醇沉，测定醇沉液中黄芪甲苷质量浓度，计算醇沉后黄芪甲苷转移率。记录结果显示，用体积分数60%、70%、80%、90%乙醇沉淀黄芪甲苷转移率分别为52.10%、50.63%、43.24%、37.85%，数据表明80%以上浓度醇沉黄芪甲苷有损失，60%和70%醇沉差异无显著性，因此采用60%醇沉工艺。对3份同批次1个处方量的药材进行醇沉工艺试验验证，结果显示黄芪甲苷平均转移率为52.23%，与选取结果较近，表明醇沉工艺稳定可行。

2.4成型工艺

2.4.1 配液工艺优选

分别称取同批次4 个处方量的药材，加入5倍量水，煎煮提取2次，每次2 h，然后水煎煮液合并减压浓缩至适量，放冷，加入体积分数为60%乙醇醇沉，制得样品浸膏，然后将样品平均分成4份，分别加水至1 L，混匀，加入等量活性炭，煮沸热处理时间分别为0、10、20、30 min，趁热滤过，滤液放冷后置冰柜中冷藏3 d，自然沉降，离心分离，灌封，灭菌，得样品。静置观察性状，结果显示只有热处理时间为20、30 min的样品保持澄清。测定所得样品中黄芪甲苷质量浓度，记录结果分别为87.48、87.22、87.00、87.03 μg/mL。该结果表明采用先加热处理再冷藏的方式可以提高肺痨灵合剂的澄清度，热处理20 min即可使肺痨灵合剂达到澄清状态，为节时节能，故选择热处理时间为20 min。

2.4.2 挥发油增溶工艺考察

分别量取5份制备好的样品溶液500 mL，置于1 L烧杯中，各取出样品溶液100 mL，然后分别加入2.5、5.0、7.5、10、12.5 mL吐温-80和3.4 mL挥发油搅拌制成乳剂后，加入到剩余400 mL样品溶液中，置冰柜中冷藏2 d，离心、抽滤、灌封、高压灭菌，得肺痨灵合剂，观察其澄清度变化[25-26]。结果显示，吐温-80的用量为样品量的1.5%～2%时溶液澄清度较好，因此为减少增溶剂吐温-80的用量，节约成本，选择吐温-80用量为1.5%。分别称取3批按照优选挥发油提取工艺、水提醇沉工艺、配液工艺制得样品溶液，分别加入1.5%样品量的吐温-80进行挥发油增溶，结果发现肺痨灵合剂澄清度良好，表明该增溶工艺稳定、可行。

2.5 肺痨灵合剂制备工艺验证

分别称取15份同批次处方量的药材，均按照上文中确定的最佳制备工艺制备肺痨灵合剂样品，分别读取挥发油提取量、计算黄芪甲苷转移率、观察样品溶液的澄清度，数据显示挥发油平均提取量为3.35 mL，黄芪甲苷质量浓度平均为87.01 μg/mL，合剂澄清，均符合质量标准要求且工艺基本稳定。

3 讨论

肺痨灵合剂为我院自主研发免疫类中药协定处方，临床用于辅助治疗肺结核，能明显提高机体免疫力，减轻常规化学药物的不良反应，提高患者依从性。但该复方药材种类繁多，成分复杂，制备方法科学与否直接影响其临床疗效，探索研究该汤剂的制备工艺，是保证肺痨灵合剂质量的重要方法。本文根据处方中药材性质的不同，通过正交实验设计，探讨了先利用水蒸气蒸馏法提取山腊梅挥发油，然后用水煎煮法提取其他药味水溶性成分，最后再将挥发油与水提液浸膏样品混合的制备方法。最终得到的肺痨灵合剂最佳制备工艺方案是：山腊梅碎叶片中挥发油提取方法为水蒸气蒸馏法，提取时间为4 h；其他味药材药材加入5倍处方量水，提取2次，每次煎煮2 h；用体积分数为60%乙醇醇沉；加入1.5%样品量吐温-80促进挥发油增溶。经工艺验证，该制备工艺稳定可行，重复性好，能有效控制肺痨灵合剂的质量。

研究肺痨灵合剂制备工艺过程中还考察了黄芪甲苷供试品溶液的制备方法中过柱、水饱和正丁醇溶液的萃取体积、萃取次数及氨试液洗涤次数对黄芪甲苷转移率的影响，结果表明：不过柱时黄芪甲苷与相邻峰分离度达不到要求；水饱和正丁醇溶液提取4次，每次分别为60、40、40、40 mL时，提取效果最好；氨试液洗涤2次和3次，黄芪甲苷提取率无明显差异。实验曾参考有关文献，选用乙腈-水（33∶67）为流动相、乙腈-水-四氢呋喃（33∶67∶4）为流动相，流速：0.8 mL/min，以Aichrom Reliasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱为分析柱，柱温为25℃，ELSD参数：漂移管温度70℃，氮气压力45 Pa，进行试验研究，结果两者达到满意的分离效果，黄芪甲苷峰已达基线分离，峰形对称；缺黄芪阴性对照样品均无干扰。本实验选用乙腈-水（33∶67）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温为30℃；用Alltech2000 ES蒸发光散射检测器检测：漂移管温度101℃，气体流速2.7 L/min。

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