结直肠腺癌组织中c—JUN氨基末端激酶、E—选择素、血管内皮生长因子—D蛋白表达的临床意义

庆琳琳　胡继春

[摘要] 目的 探讨c-JUN氨基末端激酶（c-JUN）、E-选择素（E-selectin）、血管内皮生长因子-D蛋白（VEGF-D）蛋白在结直肠腺癌发展和转移中的作用。 方法 收集2012年8月～2014年9月于北京市海淀医院手术切除的正常大肠黏膜组织标本（20例）和结直肠腺癌标本（50例），应用免疫组化法检测标本中c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白的表达，观察c-JUN、E-selectin、VEGF-D与临床病理的联系及c-JUN与E-selectin、VEGF-D的相关性。 结果 ①结直肠癌组织中，c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白表达的阳性率（84%、78%、92%）显著高于正常大肠黏膜组织（5%、10%、10%），差异有高度统计学意义（P < 0.01）；②c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白的表达与Dukes分期及有无淋巴结转移有关（P < 0.05）；③c-JUN与E-selectin呈正相关（r = 0.6394，P < 0.05），c-JUN与VEGF-D呈正相关（r = 0.6592，P < 0.05）。 结论 E-selectin、VEGF-D蛋白与结直肠腺癌发展和转移有关，c-JUN可能调控E-selectin、VEGF-D的表达。

[关键词] 结直肠癌；c-JUN氨基末端激酶；E-选择素；血管内皮生长因子-D蛋白

[中图分类号] R737.24 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（b）-0095-04

[Abstract] Objective To investigate the role of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein in the development and metastasis of colorectal carcinoma. Methods From August 2012 to September 2014， 20 normal tissues and 50 colorectal carainomas samples from surgical resection in Beijing Haidian Hospital were selected. The expression of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein in these samples were detected by immunohistochemistry， the relationship of c-JUN， E-selectin， VEGF-D with clinical pathologh was observed， and the correlation of c-JUN with E-selectin and VEGF-D was analyzed. Results ①The positive rate of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein （84%， 78%， 92%） in colorectal tumor tissues were significantly higher than those in normal tissues （5%， 10%， 10%）， the differences were statistically significant （P < 0.01）. ②The positive rates of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein were associated with Dukes stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. ③A significant positive relation was observed between the positive rate of c-JUN and E-selectin （r = 0.6394， P < 0.05）， and a significant positive relation was observed between the positive rate of c-JUN and VEGF-D （r = 0.6592， P < 0.05）. Conclusion The expression of c-JUN， E-selectin， VEGF-D protein may be involved in the development and metastasis. The expression of E-selectin and VEGF-D may be regulated by c-JUN protein.

[Key words] Colorectal carcinoma； c-JUN； E-selectin； VEGF-D

结直肠腺癌是一种发病率较高的消化道恶性肿瘤，近年来发病率有增高的趋势，其生长迅速与转移的特性一直为研究者所关注，病理学改变最显著的特征是新生血管及淋巴管生成，研究表明血管内皮生长因子-D（vascular endothelial growth factor D，VEGF-D）在瘤体组织中高表达与以上病理改变可能有相关性[1-2]。另外，E-选择素（E-selectin）同样可以在某些肿瘤组织中有高表达，可能介导肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附，增加血管基底膜的通透性，进而导致肿瘤细胞转移[3]，但VEGF-D和E-selectin在结直肠腺癌组织中的同时表达是否与肿瘤生长与转移有关则研究较少。近年来，肿瘤研究中基因调控的观点逐渐被提出并证明，即肿瘤的发生与进展都由某些信号传导通路所控制，而在这些通路中的关键蛋白因子可能是影响肿瘤形成与转归的关键位点。在结直肠腺癌中，参与机体中多种重要免疫反应的c-JUN氨基末端激酶（c-JUN NH2-terminal kinase，c-JUN）是否对E-selectin和VEGF-D的表达有调控作用也是需要研究的关键点。基于以上研究背景，本研究收集并检测结直肠腺癌组织中c-JUN、VEGF-D、E-selectin蛋白的表达并探讨与病理特征的相关性，分析临床意义，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年8月～2014年9月于北京市海淀医院普通外科手术切除的50例结直肠癌组织和20例正常大肠组织（非结直肠癌）。结直肠癌患者50例中，男37例，女13例；年龄37～78岁；结直肠癌Dukes分期：A期5例，B期17例，C期20例，D期8例；有淋巴结转移者35例，无淋巴结转移者15例；术前均未接受放、化疗及免疫治疗，术后均经病理检查证实。非结直肠癌患者20例中，男14例，女6例，年龄30～72岁。本研究经医院伦理委员会审查通过，患者均签署知情同意书。

1.2 c-JUN、E-selectin、VEGF-D蛋白检测

试剂盒购自武汉博士德生物技术公司，所有组织均经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm厚病理切片，贴附于多聚赖氨酸的载玻片上。采用免疫组化SP法检测，一抗均为鼠抗人单克隆抗体，DAB显色，全部操作过程均按试剂说明书进行，用已知阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）替代一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准[4]

采用双人双盲法判定，免疫组化阳性初步判定标准为细胞核或细胞核与细胞质中同时出现棕黄色颗粒，①阳性细胞百分比评定标准：随机选取4个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的百分比，0分为阳性细胞数百分比为0，1分为阳性细胞数≤10%，2分为10%<阳性细胞数百分比≤50%，3分为50%<阳性细胞数≤75%，4分为阳性细胞数>75%。②染色强度评分标准：0分为无显色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。免疫组化最终结果判定标准：阳性细胞百分比与染色强度评分的乘积< 3为免疫组化结果阴性，≥3为免疫组化结果阳性。

1.4 统计学方法

所有数据用SPSS 12.00对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验；相关性分析应用Spearman相关分析法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

3 讨论

结直肠腺癌作为一种发病率较高的消化道恶性肿瘤，已经被基础与临床研究工作者所关注，从病理特征上观察，其具有其他恶性肿瘤的共同特点：瘤体失控性迅速生长，并发生原发肿瘤部位以外的远端转移。对于恶性肿瘤的生长及转移，虽然其确切的机制未完全阐明，但大量病理研究结果表明：肿瘤组织内可见新生血管及淋巴管大量形成，这些新生血管一方面可以为肿瘤细胞的生长提供营养支持，另一方面可能为肿瘤细胞的转移提供条件。所以，肿瘤组织内新生血管与淋巴管的大量增生是肿瘤生长与发展的必要条件，研究分析这些病理改变的相关因素可能为进一步了解肿瘤的发病机制提供新的途径。

在正常生理情况下，机体内存在一个“精密”的调控体系，对于一般性损伤所需要的修复可以通过一些“免疫因子”来完成，VEGF是一类能促进血管内皮生长的免疫因子，可以由血管内皮细胞产生释放，促进血管形成及生长[5]，在正常生理条件下，VEGF表达较少，但在病理条件下，在某些恶性肿瘤组织中可以检测到其高表达，已有研究报道在乳腺癌、肝癌、大肠癌等肿瘤疾患中VEGF有高表达[6-8]。VEGF-D是VEGF的一个亚型，与VEGF-C有近50%的基因同源性，据研究主要作用是促进新生血管生长，并且可以增加血管内皮细胞的通透性。在以往的研究中发现[9]，在胃肠道肿瘤疾患中，VEGF-D在肿瘤组织内特异性染色检查显示有高表达，表明可能有促进肿瘤组织中新生血管形成的作用，即VEGF-D对肿瘤的生长有促进作用。所以，最新的观点认为VEGF-D是一种较强的肿瘤生长刺激因子。本研究观察也验证了这一观点：在结直肠腺癌中，VEGF-D表达增高，并随肿瘤的病理分期进展而持续增加，同时在有淋巴结转移的病例中有较高表达，提示其与结直肠癌的发展及转移密切相关。

恶性肿瘤细胞的转移是恶性肿瘤特征的另一大表现，据研究，恶性肿瘤细胞可以浸润性生长并突破血管的基底膜进入血液循环发生远端转移，其相关作用机制较为复杂，可能有多种相关免疫蛋白参与，经过多年研究，现在一致的观点认为：首先，是恶性肿瘤细胞自身会发生变异，逃避机体免疫免疫系统的发现与清除；其次，某些活性免疫蛋白分子可以在瘤体局部活性增高，诱使肿瘤细胞较易发生局部位移，突破血管基底膜进入血液循环，最终发生距离较远的迁移与种植[10]。E-selectin是一种免疫因子，属于选择素家族中的一个重要成员，可以由血管内皮细胞分泌，作用为促进炎性反应细胞（中性粒细胞、巨噬细胞等）与血管内皮细胞发生黏附，为炎性细胞到达炎症部位发挥作用而创造条件[11]。在某些肿瘤疾患中，E-selectin的高表达与肿瘤细胞的转移可能存在密切的联系，如胃癌患者肿瘤组织内和血清中都可以检测到E-selectin分泌水平高于正常健康人，并与肿瘤分级和有无淋巴结转移有密切关系[12]。本研究结果也可以观察到E-selectin在肿瘤组织内的表达增高，与VEGF-D一样，随肿瘤病理分期加深和淋巴结转移而进一步增加。

近年来，在肿瘤相关研究中，基因调控的观点备受关注，即许多免疫蛋白的表达都可能有一个或几个信号传导途径参与调控，在这些途径上的关键调控因子则成了研究的热点[13]。C-JUN是机体内一个重要的调控通路的位点，属于有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen actived protein kinase，MAPK）的一个重要的细胞内信号传到通路，与细胞的代谢、生长、增殖有关[14]。有研究表明[15-16]：肿瘤组织内免疫组化检测可见c-JUN蛋白呈强染色表达，提示肿瘤细胞增生分化可能有c-JUN蛋白信号传导通路参与，但具体作用机制未完全阐明。在本研究中也可以观察到c-JUN的表达增高，统计学分析显示c-JUN与VEGF-D和E-selectin的表达均有正相关性，此结果提示 c-JUN蛋白可能是VEGF-D和E-selectin蛋白分泌的一个上位调控位点，c-JUN增高，促进VEGF-D和E-selectin的相应增高，提示 c-JUN对VEGF-D和E-selectin有调控作用。c-JUN是上位控制蛋白，而VEGF-D和E-selectin是下位“靶蛋白”，在正常情况下，应该存在负反馈调节，但肿瘤疾患中，原有的调节系统会出现紊乱，可能出现与正常调节相反的正反馈调节，促进肿瘤的生长。依据以上推论，假设如果能控制肿瘤组织中c-JUN的高表达，是否可以控制VEGF-D和E-selectin的过量分泌，但从现今的研究进展看，肿瘤的发生、发展是一个多种免疫蛋白参与的复杂过程，更加复杂的是多种免疫蛋白还存在相互作用的网络性[17-18]，c-JUN信号传导通路可能并非是结直肠癌中唯一的信号传导调控通路，随着分子生物学的研究进展势必有更多的信号传导通路会被发现，所以现在的研究结果并非能全面阐述肿瘤的发生与演变，特别是仅几个免疫蛋白的表达变化并不能完全反映机体整体的免疫变化，还需要大量的研究提供重要的线索来充分阐明肿瘤发生与发展的确切作用机制，为将来更多的有效治疗提供新的依据。

本研究对结直肠癌组织中VEGF-D和E-selectin的表达进行检测，结果提示两者表达的共同增加是一个明显的特征性改变，VEGF-D可以促进血管及淋巴管不断增生，瘤体血运丰富，肿瘤细胞生长活跃，但肿瘤细胞仅在局部生长而不能移动，则不会发生转移。恶性肿瘤细胞的转移必然需要其他免疫因子的帮助，E-selectin可能起到了关键作用，其在肿瘤组织内部大量表达，推测可能促进了肿瘤细胞与血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞的黏附，一旦突破了基底膜，肿瘤细胞便会发生转移。两者之间还可能存在协同促进作用，但具体机制还需要更加深入的研究。

综上所述，VEGF-D和E-selectin与结直肠癌的发展与转移有关，c-JUN可能调控VEGF-D和E-selectin的表达。但由于本研究结果还有很大的局限性，更确切的机制还需要进一步的研究。

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（收稿日期：2014-11-08 本文编辑：苏 畅）