浆细胞样树突状细胞对频繁复发的生殖器疱疹的免疫作用

杨闰平，李安信，李晓鹏，刘元林

生殖器疱疹一般由单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）－2（少数为 HSV－1）感染生殖器皮肤黏膜而导致簇集性水疱性的性传播疾病，病情不活动时HSV可潜伏在局部神经节中。生殖器疱疹难以根治，容易复发。一般认为复发频率与患者的免疫功能状态有关，一年内复发超过6次为频繁复发。

浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells,pDCs）主要功能和特征是在病毒或病毒来源的核酸刺激下分泌Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）（IFNα/β），参与机体免疫反应以及桥接机体固有免疫和适应性免疫[1]。近年来发现pDCs在生殖器疱疹皮损中有浸润，且HSV暴露后的pDCs在体外可促进T淋巴细胞的增殖，认为pDCs参与了生殖器疱疹的抗病毒免疫反应[2]。但有研究发现pDCs仅对系统感染的HSV有免疫反应，对局部感染的HSV无免疫反应，即pDCs对HSV的不同感染途径有选择性的免疫作用[3]。本文主要研究pDCs在复发性生殖器疱疹中的免疫作用，探索其在预防生殖器疱疹复发中的可能角色。

1 对象与方法

1.1 对象 选取我院门诊确诊的10例生殖器疱疹患者。入组标准：①年龄＞18岁男性；②病程1年以上；③复发频率≥6次/年；④诊断标准符合《梅毒、淋病、生殖器疱疹、生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南（2014）》[4]。剔除标准：①肿瘤患者、严重心脑血管病及结缔组织病等系统疾病患者；②有酗酒习惯，抽烟＞20支/d。获取知情同意后于静息期（2次疾病发作间期）、发病早期（病程第1 d）和发病后期（病程第6 d）分别空腹抽取患者静脉血6ml，3ml置于肝素抗凝管进行白细胞分离备用，3ml置于促凝管进行血清分离备用。选10名健康成年男性为对照组，其静脉血处理同前。

1.2 外周血白细胞的分离 采用P8670人外周血白细胞分离液solarbio试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）分离白细胞，严格按试剂盒要求进行操作。方法如下：将1 ml新鲜抗凝血用组织稀释液1∶1稀释，加于1份分离液之液面上，1800 r/min离心25 min。弃去第1层血浆层，收集第2层细胞、第3层分离液层和第4层红细胞层，置于含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，1800 r/min离心30min。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞。

1.3 流式细胞术检测 PBS调整分离好的白细胞细胞密度至1×106个/ml，取1ml细胞悬液，依次加入CD123－FITC抗体（ab95782，艾博抗上海贸易有限公司）和BDCA－2－PE抗体（上海微蒙生物技术有限公司），4℃避光孵育30min，加PBS 1ml离心洗涤以洗去未标记抗体，加PBS调至200μl体积重悬细胞，上流式细胞仪检测（BD FACSCalibur），以WinMD 12.9软件记录并分析结果。

1.4白细胞的培养上清液分离 分离白细胞以2×106个/ml的密度接种到25m l培养瓶中，用RPMI1640培养液（上海元龙生物技术有限公司）37℃培养24 h。分为培养液单纯培养和加入1μg/ml的BDCA－2抗体（上海微蒙生物技术有限公司）预处理2组，分别加入PBS、IFNα1b（赛诺金，深圳科兴生物工程有限公司，30 μg/ml）、HSV－2 333（南昌大学医学院病毒所提供，100 TCID50/ml）和寡聚脱氧核苷酸（CpG－oligodeoxynueleotide,CpG ODN）（按参考文献[5]进行，由上海生物工程公司合成，终浓度为6μg/ml）共培养24 h，24 h后以1000 r/m离心10min，取上清液于－20℃保存备用。

1.5 双抗体夹心ELISA检测血清及培养上清液IFNα/γ 具体实验步骤严格按照IFNα/γ双抗体夹心ELISA试剂盒（厦门慧嘉生物公司）说明书进行操作。标准品浓度按倍比稀释。用酶标仪在450nm处检测吸光度（OD值），根据标准曲线测出样品浓度，结果以ng/L表示。

1.6 统计学处理 用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料呈正态分布，用x±s表示。患者指标在不同病期的变化比较用单因素重复测量设计的方差分析。外周血白细胞在IFNα等刺激下培养的上清液中IFNγ水平变化比较用自身配对t检验，差值比较用成组t检验。对照组外周血白细胞在BDCA－2抗体和IFNα等共刺激后培养上清液IFN γ水平的比较用单因素方差分析，多重比较用SNK法。相关数据均满足正态分布，组间方差齐。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同病期外周血pDCs水平变化 以对照组pDCs水平（0.511±0.131）为正常参考值，患者疾病各期pDCs百分比均低于正常参考值，静息期和发病早期差异无统计学意义，但发病后期明显低于前2期，差异均有统计学意义（表1）。

表1 患者不同病期pDCs水平变化（n=10，x±s，%）Table 1 Changes of percentages of pDCs at different stages of genital herpes(n=10,x±s,%)

2.2 不同病期血清IFNα和IFNγ水平变化

以对照组IFNα和IFNγ水平为正常参考值，分别为（51.474±8.269）和（116.665±15.318）ng/L。患者IFNα水平在不同病期均高于正常参考值，发病早期高于静息期，发病后期有所下降，但是仍高于静息期，差异均有统计学意义。患者IFNγ水平在不同病期呈依次升高，差异均有统计学意义，静息期略低于正常参考值，发病早期和后期均高于正常参考值（表2）。

表2 患者不同病期IFNα和IFNγ水平变化（n=10，x±s，ng/L）Table 2 Changes of serum IFNαand IFNγat different stages of genital herpes(n=10,x±s,ng/L)

2.3 IFNα、HSV－2和CpG ODN对外周血白细胞产IFNγ的影响 分离静息期和对照组外周血白细胞体外培养24 h，ELISA分析培养上清液中IFNγ水平。结果显示在加入IFNα、HSV－2和CpGODN后静息期白细胞培养上清液中IFNγ水平显著低于对照组，差异有统计学意义（表3）。

表3 外周血白细胞分别在IFNα、HSV-2和CpG ODN刺激下培养上清液中IFNγ水平比较（x±s,ng/L)Table 3 Comparison of IFNγin supernate of peripheral white blood cell culture stimulated by IFNα,HSV-2 and CpG-ODN(x±s,ng/L)

2.4 BDCA－2抗体对 IFN α、HSV－2和 CpG ODN刺激外周血白细胞产IFNγ的影响 BDCA－2抗体可显著抑制HSV－2组和CpG ODN组培养上清液中IFNγ水平，与对照组差异无统计学意义；而BDCA－2抗体对IFNα组无影响，其上清液IFNγ水平显著高于其余3组，差异有统计学意义（表4）。

3 讨 论

pDCs来源于骨髓，存在于健康人血液及淋巴结组织中，皮肤组织中少见，占人外周血单核细胞的0.2%～0.8%，主要通过分泌大量IFNα参与机体的免疫调节，是其他白细胞分泌IFNα的100～1000倍[1]。pDCs内含有体内表达Toll样受体7和9，结合自身核苷和病原体来源核苷，诱导pDCs分泌IFNα，从而发挥抗病毒作用[6]。既往研究发现生殖器疱疹皮损真皮有pDCs浸润，参与抗病毒免疫[2]。但本研究发现在复发性生殖器疱疹静息期和发病早期外周血pDCs百分比与对照组差异无统计学意义，发病后期pDCs数量显著减少，说明静息期和发病早期患者外周血pDCs储备无明显改变，而发病后期由于HSV激活复制，迅速动员pDCs分泌IFNα，可能存在耗竭性减少。

表4 对照组外周血白细胞在BDCA-2抗体与IFNα、HSV-2和CpG-ODN共刺激培养上清液中IFNγ水平比较（x±s,ng/L)Table 4 Com parison of IFNγin supernate of peripheral white blood cell culture stimulated by BDCA-2 and IFNα,HSV-2and CpG-ODN respectively in the controls(x±s,ng/L)

IFNα在人体抗病毒免疫中起重要作用，不仅直接抗病毒，也可以调节机体免疫，目前注射及外用IFN是各种病毒性疾病治疗的常用方法[7－8]。研究发现复发性生殖器疱疹患者存在辅助性T细胞（T helper cells,Th）1和Th2细胞的失衡，表现为白细胞介素（interleukin,IL）－10产生过多，而 IFN γ及IL－2产生过少[9]。Mezentseva等[10]研究证明生殖器疱疹患者产生IFNα/γ能力明显降低，因此复发性生殖器疱疹患者存在免疫失衡。本研究发现频繁复发的生殖器疱疹患者静息期外周血IFNα水平高于对照组，IFNγ水平低于对照组；IFNα水平在发病初期显著升高，而发病后期迅速下降，IFNγ依然较对照组显著升高。提示IFNα参与生殖器疱疹的早期免疫，而后期IFNγ进行持续抗病毒免疫。

既往研究表明复发性生殖器疱疹患者外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值降低，直接影响患者免疫状态，是导致生殖器疱疹复发的一个主要原因。在抗病毒免疫中Th1通过分泌IFNγ介导的细胞免疫起主要作用[11－12]。研究发现pDCs通过分泌IFN α作用于T细胞，使T细胞向Th1分化，分泌大量的IFNγ参与机体抗病毒免疫[2]。本研究发现IFN α、HSV－2和CpG ODN均可刺激外周血分离白细胞产生IFNγ。BDCA－2是pDCs细胞表面C型凝集素，是pDCs的一种特异性抗原，BDCA－2抗体可有效抑制pDCs产生IFNα/β[13]。本研究显示BDCA－2抗体抑制HSV－2和CpGODN对外周血白细胞产生IFNγ，而对IFNα的诱导作用无效，说明pDCs参与了白细胞分泌IFNγ的免疫调节。复发性生殖器疱疹患者外周血白细胞培养上清液中IFNγ水平显著低于对照组，提示其Th1细胞对pDCs反应性减低，或与患者外周血中Th1和Th2的失衡有关。

综上所述，pDCs参与了复发性生殖器疱疹的免疫反应，其作用机制可能是通过分泌IFNα参与早期抗病毒免疫，以及诱导外周血Th1分泌IFNγ参与疱疹的免疫反应。频繁复发的生殖器疱疹患者存在Th1淋巴细胞对pDCs介导的免疫反应减低。

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