全反式维甲酸对宫颈癌耐药细胞株HeLa/MMC侵袭、转移能力的影响及其分子机制研究

胡海燕 刘植华

南方医科大学附属深圳市妇幼保健院，广东深圳518000

全反式维甲酸对宫颈癌耐药细胞株HeLa/MMC侵袭、转移能力的影响及其分子机制研究

胡海燕 刘植华▲

南方医科大学附属深圳市妇幼保健院，广东深圳518000

目的观察全反式维甲酸(ATRA)对宫颈癌耐药细胞株HeLa/MMC侵袭、转移能力的影响，并探讨其分子机制。方法分别用不同浓度ATRA(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)处理对数生长期HeLa/MMC细胞，以Transwell小室检测细胞侵袭、转移能力的变化;采用CCK-8法检测经1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L ATRA处理后的细胞增殖情况;通过流式细胞仪观察1×10-6mol/L ATRA处理HeLa/MMC细胞3、7 d后细胞周期的变化;半定量RT-PCR检测1×10-6mol/L ATRA处理HeLa/MMC细胞3、7 d后细胞c-myc mRNA水平变化。结果①Transwell小室结果显示，1×10-7mol/L ATRA组、1×10-6mol/L ATRA组、1×10-5mol/L ATRA组细胞侵袭数、转移数［(40±6)、(73±7)个，(26±4)、(61±4)个，(16±3)、(49±5)个)］均减少，与对照组［(63±9)、(89±9)个］比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。②CCK-8法检测细胞增殖结果显示，随着全反式维甲酸药物浓度的递增，HeLa/MMC细胞增殖逐渐被抑制;实验各组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。③流式细胞仪检测结果显示，全反式维甲酸使进入S期耐药细胞数减少。1×10-6mol/L ATRA处理3、7 d S期细胞比例分别为(14.90±0.21)%、(6.48±0.18)%;两个实验组与对照组(16.28±0.12)%比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。④RT-PCR结果显示，全反式维甲酸下调癌基因c-myc的转录。1×10-6mol/L ATRA处理3、7 d c-myc mRNA相对表达量分别为(0.5406±0.0011)、(0.4312± 0.0009);两个实验组与对照组(0.6804±0.0012)比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论全反式维甲酸可抑制宫颈癌耐药细胞株的侵袭、转移，其机制可能通过下调癌基因c-myc转录实现。

宫颈肿瘤;维甲酸;转移;侵袭

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是由维生素A在人体内代谢生成的高活性衍生物，对胚胎发育过程中细胞分化以及机体的生长、发育均具有重要调节作用［1］。到目前为止，ATRA用于急性早幼粒白血病治疗的基础与临床研究较为深入［2-3］，而有关人体实体瘤的分化研究，已见报道的有结肠癌、胃癌、肺鳞状上皮癌、乳腺癌等［4-5］。本课题组的前期研究显示，ATRA能有效抑制宫颈癌细胞HeLa增殖并诱导其分化，且能提高宫颈癌耐药细胞株HeLa/MMC对化疗的敏感性［6］。宫颈癌耐药细胞株HeLa/MMC较其亲本细胞HeLa增殖更快、恶性度更高。本研究以宫颈癌耐丝裂霉素细胞株HeLa/MMC为研究对象，体外观察ATRA对宫颈癌耐药细胞侵袭、转移能力的影响，探讨其作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ATRA、二甲基亚矾(DMSO)、PI、CCK-8试剂盒、RNase(Sigma公司、美国)。Transwell小室(Corning公司、美国)。SV总RNA分离试剂盒(Promega公司、美国)。One step RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司、中国)。引物由中国上海Invitrogen公司合成。

1.2 耐药细胞株HeLa/MMC的建立

耐药细胞株由武汉大学中南医院肿瘤研究所惠赠。通过连续性给药，间歇性增加药量，逐步提高宫颈癌HeLa细胞培养液中丝裂霉素浓度，获得对丝裂霉素5.02倍耐药，对顺铂2倍耐药的HeLa/MMC细胞株。该细胞株对长春新碱、5-氟尿嘧啶、阿霉素保持敏感。

1.3 方法

1.3.1 耐药细胞的培养HeLa/MMC细胞培养于含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，培养液中加入丝裂霉素维持其耐药性，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。视细胞生长情况隔天换液1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 Transwell小室检测耐药细胞的侵袭、转移能力取对数生长期细胞，细胞计数后调整细胞浓度为1× 106个/mL。细胞转移试验中，在Transwell小室的上室中加入100 μL细胞悬液。细胞侵袭实验，用无血清预冷的DMEM稀释Matrigel胶(3∶1)。加30 μL稀释的Matrigel于Transwell小室的上室，37℃放置过夜。上室加入100 μL细胞悬液，设3个复孔。实验组加入三种浓度ATRA(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)。下室中加入含有10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液。阴性对照组加入相应体积培养液。置于5%CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养36 h。取出小室，用棉签拭去小室内细胞和Matrigel胶，PBS冲洗，10%甲醛固定15 min，PBS冲洗，0.1%结晶紫染色30 min，清水冲洗后倒置显微镜下观察计数。每个样本随机取5个高倍镜视野(200×)计细胞数，取其平均值。

1.3.3 CCK-8法检测耐药细胞的增殖情况将对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔5×103个细胞，实验组分别加入不同浓度的ATRA(1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L)，阴性对照组不加药物，空白对照组无细胞，仅加入相应体积的培养液，各组均设3个复孔。共培养24 h后吸去培养液，每孔加含CCK-8 10 μL的完全培养基100 μL，继续于37℃5%CO2培养箱中培养3 h，用酶联仪测450 nm处的OD值。

1.3.4 流式细胞仪检测耐药细胞的细胞周期用胰酶将1×10-6mol/L ATRA分别作用3、7 d的实验组细胞及对照组细胞消化成单细胞悬液，预冷过的70%乙醇固定细胞，4℃冰箱保存。上流式细胞仪检测前弃乙醇，加入RNA酶作用30 min，100 μg/mL PI染色液4℃避光染色30 min，细胞经300目过滤网后上机检测。各组测1×104个细胞，经计算机软件处理得出细胞周期各时相百分比(%)。实验重复3次。

1.3.5 半定量RT-PCR分析耐药细胞的c-myc基因表达收集1×10-6mol/LATRA分别作用3、7 d的细胞及对照组细胞，按SV总RNA分离试剂盒说明提取细胞RNA。引物序列设计如下:c-myc上游5’-CTC TCAACGACAGCAGCCCG-3’，下游5’-AGG TGA TCC AGA CTC TGA CC-3’;β-actin上游5’-CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGG GAC C-3’，下游5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G-3’。扩增DNA片段大小:c-myc 250 bp，β-actin 600 bp。依据TaKaRa公司的one step RT-PCR试剂盒的操作说明，将反应体系置于DNA循环仪中，42℃逆转录60 min，合成互补DNA。95℃预变性5 min，再进行PCR循环。PCR循环条件:95℃变性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸1 min。共计30个循环后，72℃延伸7 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测拍照记录结果。采用HPIAS-2000型图像分析系统扫描测定，以基因β-actin作为内参照，计算c-myc mRNA的相对表达量并比较表达差异。实验重复3次。

1.4 统计学方法

用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示。采用one-way ANOVA做多组均数比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞侵袭、转移能力的变化

Transwell小室检测细胞侵袭、转移能力结果显示:经ATRA处理过的HeLa/MMC细胞侵袭数及转移数均明显减少，且随着药物浓度增加，细胞侵袭数及转移数减少。与对照组比较，ATRA各浓度实验组的侵袭细胞数、转移细胞数差异有统计学意义(P＜0.05)。说明ATRA能抑制宫颈癌耐药细胞HeLa/MMC的侵袭和转移能力。见表1。

表1 全反式维甲酸对HeLa/MMC细胞侵袭、转移能力的影响(个，±s)

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05

组别侵袭细胞数转移细胞数阴性对照组实验组1 × 1 0-7m o l / L A T R A 1 × 1 0-6m o l / L A T R A 1 × 1 0-5m o l / L A T R A 6 3 ± 9 8 9 ± 9 4 0 ± 6*2 6 ± 4*1 6 ± 3*7 3 ± 7*6 1 ± 4*4 9 ± 5*

2.2 CCK-8法测定耐药细胞的增殖情况

实验组经1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5mol/L ATRA处理后的HeLa/MMC细胞，细胞增殖被抑制。ATRA在1×10-7mol/L的低浓度下就有抑制耐药细胞株增殖作用，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且随着浓度递增，抑制作用逐渐增强。ATRA抑制耐药细胞增殖的作用存在一定的剂量依赖关系。见表2。

表2 全反式维甲酸对HeLa/MMC细胞的生长抑制作用(±s)

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05

组别O D值空白对照组阴性对照组实验组1 × 1 0-7m o l / L A T R A 5 × 1 0-7m o l / L A T R A 1 × 1 0-6m o l / L A T R A 5 × 1 0-6m o l / L A T R A 1 × 1 0-5m o l / L A T R A 1 0 . 8 5 3 ± 0 . 0 2 4 0 . 5 9 3 ± 0 . 0 3 4*0 . 4 6 6 ± 0 . 0 1 3*0 . 4 2 3 ± 0 . 0 2 2*0 . 3 9 1 ± 0 . 0 1 8*0 . 3 6 7 ± 0 . 0 2 9*

2.3 流式细胞仪检测耐药细胞细胞周期的变化

HeLa/MMC细胞经1×10-6mol/L ATRA处理3 d后细胞周期分布的变化，表现在细胞堆积在G1/G0期，而进入S期细胞相应减少。与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。随着ATRA药物作用时间的延长，堆积在G1/G0期的细胞比例逐步升高，进入S期的细胞比例相应降低。提示ATRA能阻止HeLa/MMC细胞由G1/G0期进入S期。见表3。

表3HeLa/MMC细胞周期分布(%，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;ATRA1实验组:1×10-6mol/L全反式维甲酸处理3 d;ATRA2实验组:1×10-6mol/L全反式维甲酸处理7 d

组别G1/ G0期S期G2+ M期对照组A T R A1实验组A T R A2实验组6 7 . 4 3 ± 0 . 3 8 7 1 . 9 2 ± 0 . 2 1 8 1 . 7 5 ± 0 . 1 3 1 6 . 2 8 ± 0 . 1 2 1 4 . 9 0 ± 0 . 2 1*6 . 4 8 ± 0 . 1 8*1 6 . 2 9 ± 0 . 2 1 1 3 . 1 5 ± 0 . 1 4 1 1 . 7 7 ± 0 . 1 9

2.4 c-myc基因RT-PCR扩增片段的电泳结果

实验组和对照组(图1)均可见两条基因片段: 250 bp的c-myc(目的基因)和600 bp的β-actin(内参基因)。经1×10-6mol/LATRA分别处理3、7 d后的HeLa/MMC细胞c-myc mRNA相对表达量较对照组减少(见图1c、d)。

2.5 c-myc基因RT-PCR扩增片段的半定量结果

对照组细胞c-myc mRNA相对表达量为(0.6804± 0.0012)。细胞经1×10-6mol/LATRA处理3 d后的c-myc mRNA相对表达量为(0.5406±0.0011)，低于对照组。细胞经1×10-6mol/LATRA作用至7 d时，c-myc mRNA相对表达量降至(0.4312±0.0009)。实验组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，这提示ATRA抑制了c-myc癌基因的转录。见表4。

表4c-myc基因RT-PCR扩增片段半定量结果(s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;ATRA1实验组:1×10-6mol/L全反式维甲酸处理3 d;ATRA2实验组:1×10-6mol/L全反式维甲酸处理7 d

组别c -m y c / β -a c t i n对照组A T R A1实验组A T R A2实验组0 . 6 8 0 4 ± 0 . 0 0 1 2 0 . 5 4 0 6 ± 0 . 0 0 1 1*0 . 4 3 1 2 ± 0 . 0 0 0 9*

3 讨论

子宫颈癌是发生于宫颈上皮的恶性肿瘤，是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。发病率近年来呈上升趋势，发病年龄趋于年轻化［7］，危害年轻女性的生殖健康。化疗可以缩小肿瘤病灶，控制转移灶，在晚期宫颈癌的治疗中占有重要地位［8-9］。而且术前的新辅助化疗已可替代术前放疗，提高手术成功率，同时避免放疗引起女性卵巢功能的衰退。化疗联合手术、放疗的综合治疗，对于晚期宫颈癌患者改善预后、延长患者生存时间非常重要。然而化疗失败的主要原因是患者化疗过程中出现肿瘤耐药，化疗药无法杀灭肿瘤细胞。而且治疗过程中，容易出现肿瘤的播散、远处转移，影响患者预后。ATRA作为诱导分化剂，对于调节组织器官的功能和细胞的增殖、代谢、形态分化具有重要作用，以及调控机体生长发育以及维持内环境稳定等方面发挥重要作用［10］。国内有学者发现，ATRA可抑制兔颈动脉粥样硬化斑块中血管平滑肌细胞的迁徙转移，从而抑制兔颈动脉管腔的狭窄。其作用的分子机制是下调c-myc的表达［11］。本研究旨在观察ATRA对宫颈癌耐药细胞的侵袭、转移能力的影响及癌基因c-myc转录水平的变化，探讨ATRA应对宫颈癌化疗耐药的可行性及其作用的分子靶点。

恶性肿瘤细胞的侵袭和转移能力是其区别于正常细胞的生物学特征，也是导致恶性肿瘤患者肿瘤复发、转移的重要原因。本研究应用Transwell小室检测细胞侵袭、转移能力结果显示，ATRA可抑制宫颈癌耐药细胞HeLa/MMC的侵袭、转移能力，随着药物浓度的递增，肿瘤细胞的侵袭、转移数减少。本研究发现，适当浓度ATRA能抑制HeLa/MMC细胞增殖，降低其恶性度。CCK-8细胞增殖实验结果显示，1×10-7～1×10-5mol/L的ATRA对耐药肿瘤细胞HeLa/MMC细胞的增殖有抑制作用，且这种抑制作用呈剂量依赖性。流式细胞仪检测结果显示，ATRA将肿瘤耐药细胞阻滞于G1期，使进入S期的细胞数明显减少。这从另一个角度说明ATRA使肿瘤耐药细胞阻滞于G1期，抑制肿瘤细胞的恶性增殖。

已有研究发现，肿瘤细胞中存在癌基因的异常过表达［8］。不同学者研究证实人宫颈癌及癌旁组织均有c-myc基因扩增，癌组织的扩增倍数高于癌旁组织。c-myc基因的激活和异常表达与宫颈鳞状上皮癌变过程密切相关［12］。笔者前期研究显示，耐药细胞株HeLa/MMC的恶性程度显著高于宫颈癌细胞HeLa。肿瘤细胞的侵袭、转移是个多阶段、多步骤过程，受多个基因、多个信号分子在时间、空间效应上的共同调节。经典癌基因c-myc位于人8号染色体，其编码的c-myc核蛋白，参与酪氨酸激酶信号通路，在调控肿瘤细胞增殖、侵袭、转移肿瘤耐药中起重要作用［13-14］。本研究发现ATRA下调耐药细胞癌基因c-myc的转录。随着ATRA作用时间的延长，HeLa/MMC细胞内癌基因c-mycmRNA的水平逐渐降低。故推测，ATRA可能通过转录水平下调HeLa/MMC细胞c-myc的表达，发挥其抑制宫颈癌耐药细胞侵袭、转移能力，同时诱导细胞G1期阻滞、抑制细胞增殖。由此，本研究认为c-myc基因是ATRA发挥抗肿瘤效应的关键“靶点”基因。

肿瘤化疗耐药是临床治疗恶性肿瘤的难点，也是恶性肿瘤患者预后差的重要原因。鉴于ATRA能抑制宫颈癌耐药细胞株HeLa/MMC的侵袭、转移，可以认为ATRA是一种很有前景的治疗耐药宫颈恶性肿瘤的药物，值得在其调控肿瘤耐药细胞增殖、侵袭、转移及作用机制方面的进一步深入研究。

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Effects of cell migration and invasion of human cervical cancer cell HeLa/ MMC by all-trans retinoic acid and its molecular mechanism

HU HaiyanLIU Zhihua▲The Affiliated Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital of Nanfang Medical University，Guangdong Province，Shenzhen518000，China

Objective To observe the effects of cell migration and invasion on HeLa/MMC cell induced by all-trans retinoic acid(ATRA)and discuss its molecular mechanism.Methods The HeLa/MMC cells were treated with different concentration ATRA(1×10-7，1×10-6，1×10-5mol/L)，migration and invasion ability were detected by transwell chamber assay.The HeLa/MMC cells were treated with different concentration ATRA(1×10-7，5×10-7，1×10-6，5×10-6，1×10-5mol/L)，cell proliferation was detected with CCK-8 kit.The HeLa/MMC cells were treated with 1×10-6mol/L ATRA for 3 days and 7 days，the cell cycles were analyzed by flow cytometry and the changes of c-myc mRNA levels were detected by semiquantitative RT-PCR.Results①The results of transwell chamber assay showed that after treated with 1×10-7mol/L ATRA，1×10-6mol/L ATRA，1×10-5mol/L ATRA，the cell numbers of migration and invasion were decreased［(40±6)，(73±7)；(26±4)，(61±4)；(16±3)，(49±5)］respectively；the three experiment groups were compared with those in control group［(63±9)，(89±9)］，the difference was statistically significant(P＜0.05).②After treated with ATRA，the proliferation on HeLa/MMC cells were inhibited gradually with the elevated concentration of ATRA.These experiment groups were compared with those in control group，the difference was statistically significant(P＜0.05).③ATRA inhibited Hela/MMC from G0/G1to S phrase.After treated with 1×10-6mol/L ATRA for 3，7 days，the ratio of S phrase was(14.90± 0.21)%，(6.48±0.18)%respectively.The two groups were compared with those in control group［(16.28±0.12)%］，the difference was statistically significant(P＜0.05).④ATRA inhibited c-myc transcription.After treated with 1×10-6mol/L ATRA for 3，7 days，the level of c-myc mRNA was(0.5406±0.0011)，(0.4312±0.0009)respectively.The two groups were compared with those in control group(0.6804±0.0012)，the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion ATRA can effectively inhibit the migration and invasion ability of HeLa/MMC cells.One of the mechanism is perhaps the down-regulation of the transcription of c-myc.

Cervicaltumor；Retinoicacid；Migration；Invasion

R737.7

A

1673-7210(2015)02(c)-0018-04

2 0 1 4 -1 0 -1 6本文编辑:张瑜杰)

广东省深圳市科技计划项目(编号200702062)。

▲通讯作者