肺腺癌人转录辅助因子4过表达与淋巴转移的相关性＊

孙天宇，谭群友△，史春梦，王如文，邓 波，周景海，陶绍霖，康珀铭

（1.第三军医大学大坪医院野战外科研究所胸外科，重庆400042；2.第三军医大学军事预防医学院复合伤研究所，重庆400038）

淋巴转移已成为了肺腺癌患者的主要死因[1]，目前对其具体机制知之甚少，亦缺乏早期有效的诊断和治疗方法。人转录辅助因子4（human transcriptional positive cofactor 4，PC4）是一类在人体广泛分布的核蛋白，其参与了转录、复制、染色质形成和细胞周期进展的多个正常细胞生理进程，并可通过氧化DNA损伤作用防止突变从而参与调控正常的细胞生长[2]。课题前期的体外研究发现，PC4的表达水平与人类肺癌的进展及预后相关[3]，PC4在非小细胞肺癌标本中的表达水平显著高于其邻近的非肿瘤组织[4]。本研究采用免疫组化及实时定量PCR技术检测临床患者肺腺癌组织的PC4蛋白及mRNA表达水平，分析其与淋巴转移及其他临床特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 组织标本取自2013～2014年于第三军医大学大坪医院胸外科行根治性手术治疗的96例肺腺癌患者。新切除的癌组织被收集并立即冻存于-80°C液氮中直至行PCR检测。拟行免疫组化检测的组织均送至病理科经固定、包埋后制成石蜡切片。患者术前均未接受过放疗或化疗，肿瘤不是原发性肺腺癌或患肺腺癌之前曾患过其他恶性肿瘤的患者被排除。本研究通过了第三军医大学大坪医院伦理委员会的审批，患者入组前取得了其知情同意。96例患者均按照世界卫生组织肺癌分类的标准[5]，经病理学确诊，并根据2009年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行TNM分期[6]。

1.2 方法

1.2.1 试剂 RNeasy FFPE Kit购自德国Qiagen公司，SuperScriptⅢPlatinum One-Step Quantitative RT-PCR System with ROX购自美国Invitrogen公司。兔抗PC4多克隆抗体购自英国Abcam公司，免疫组化试剂盒购自中国中杉金桥公司。

1.2.2 免疫组化检测PC4蛋白表达水平 石蜡切片经常规脱蜡复水及抗原修复后，行SP法免疫组化染色。一抗为兔抗人PC4抗体（稀释度1∶100），二抗为羊抗兔IgG抗体（稀释度1∶500）。二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染。封片后于显微镜下计数。滴加磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。阳性细胞均为细胞核染成棕黄色或棕褐色，阴性细胞不染色。两位实验人员盲法阅片，在200倍镜下随机选取至少5个视野，计算PC4阳性细胞数比例及染色强度，并参考文献[7]进行评分。染色强度评分为0～3分，同时计算不同染色强度细胞分别所占的比例，最后计算Q值。Q＝∑染色强度×比例，0～3分。PC4蛋白表达水平被分为2组，Q＜1.5为低表达组，Q≥1.5为高表达组[8]。

1.2.3 qRT-PCR检测PC4mRNA表达 采用TRIzol法提取肺腺癌总RNA，测定其水平。采用TATA盒结合蛋白（TBP）基因为内参，按照cDNA反转录试剂盒对总RNA进行逆转录反应合成cDNA，其引物顺序PC4：上游为5′-AGC GAA GCG ATG CCT AAA-3′，下游为5′-ACT TTT TGT CAA CCT CAC TGT CA-3′。TBP：上游为5′-GGA TCC CAG CAG TGC AAA C-3′，下游为5′-AAG CCG AAC TTG TAC TCA TAT TTG T-3′。反应条件：50℃15min，95℃15min，然后94℃15s，55℃45s，共45个循环。采用2-△△Ct法计算PC4mRNA的相对表达量。计算所有样本的PC4mRNA表达的平均值，并将各样本的PC4的表达水平与平均值进行比较，分为高表达组和低表达组[9]。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0进行统计学分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，采用Spearman回归曲线性相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PC4蛋白和mRNA的相关性 PC4蛋白在肺腺癌中的表达，见图1；PC4蛋白和mRNA在肺腺癌组织中表达水平分布，见图2A。PC4mRNA可能在转录水平上调了PC4蛋白的表达，在肺腺癌患者，PC4蛋白和mRNA表达之间存在明显的正相关（r＝0.63，P＜0.01），见图2B。

图1 PC4蛋白在肺腺癌组织中的表达（SP×200）

2.2 PC4蛋白表达水平与肺腺癌患者临床病理特征的关系PC4蛋白与淋巴转移（χ2＝8.29，P＜0.01）和TNM分期（χ2＝4.71，P＝0.03）显著相关，而与患者的年龄、性别、症状、吸烟史、肺部疾病史、T分期无关，见表1。

2.3 PC4mRNA表达水平与肺腺癌患者临床病理特征的关系 PC4mRNA分别与淋巴转移（χ2＝8.40，P＜0.01）和TNM分期（χ2＝5.10，P＝0.02）相关，而与患者的年龄、性别、症状、吸烟史、肺部疾病史、T分期无关，见表2。

图2 PC4蛋白与mRNA在肺腺癌患者中的表达（n＝96）

表1 PC4蛋白表达水平与肺腺癌临床病理特征的关系[n（%），n＝96]

表2 PC4mRNA表达水平与肺腺癌临床病理特征的关系[n（%），n＝96]

续表2 PC4mRNA表达水平与肺腺癌临床病理特征的关系[n（%），n＝96]

3 讨论

肺腺癌正在逐渐成为肺癌的主要病理类型，淋巴转移是导致预后不良的主要原因之一[10]。大量临床研究表明，肿瘤的某些生物学行为，如侵袭、转移、耐药性等，多存在分子水平的异常表达[11-13]；某些分子的异常表达甚至能够影响肿瘤患者的预后[14]。据此，作者推测部分肺腺癌患者也存在分子水平上的改变，导致其生物水发生改变，更易出现淋巴结转移。

PC4是一种相对分子质量为15×103的核蛋白。它广泛存在于体内并参与多种重要的生理进程，如转录、复制、DNA修复、细胞周期进展、细胞性状转化和染色质形成等。最近发现PC4的表达与人类前列腺癌、乳腺癌及肺癌的发生和发展有关，因此PC4被认为是一个能用于人类晚期癌症诊断、评估治疗效果和预测转移的新的靶分子[3]。此外，体外实验证实下调PC4表达能显著抑制非小细胞肺癌细胞的增生，并且能抑制A549细胞在裸鼠中的致瘤性[4]。本课题组前期对PC4进行了相关的研究，证实在肺癌肿瘤干细胞转化和肿瘤进展中，PC4能作为一种新的标记物[3]，PC4参与了骨髓来源的多能间充质基质细胞的增生和衰老[15]。以上的研究结果均表明PC4或许能作为一类有价值的生物标记物预测肿瘤患者的淋巴结转移和肿瘤的进展。

本研究采用免疫组化和实时定量PCR检测了肺腺癌标本中PC4蛋白和mRNA的表达，并通过分析PC4表达与临床病理特征的相关性发现，PC4表达水平与淋巴转移和TNM分期相关，高表达PC4的肺腺癌患者更易出现淋巴转移。提示PC4在肺腺癌患者中的表达水平可能与肿瘤细胞的生物学行为相关，高表达患者肿瘤细胞更加倾向于迁移至淋巴结，从而引起淋巴转移。高表达的PC4蛋白可能通过一系列信号转导激活肺腺癌淋巴转移相关基因的转录或上调其表达水平，从而促进淋巴转移。而且PC4蛋白与PC4mRNA的表达呈明显的正相关，提示此进程或许首先由PC4基因的激活启动。在外界环境中的某些因素或患者自身的遗传特征的影响下，肺腺癌患者PC4基因的表达水平被上调，PC4mRNA转录水平升高，进而导致PC4蛋白的表达增加，促进肺腺癌的淋巴转移。

本研究证实PC4在肺腺癌组织中高表达，PC4过表达与淋巴转移和TNM分期密切相关。因此，PC4可能对判断肺腺癌的淋巴转移和病理分期有一定参考价值。有关PC4表达与肺腺癌患者的生存和预后的关系还有待进一步深入研究。

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