大豆磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇单甲醚2000的制备及其性能研究

陈 龙 卫延安

(南京理工大学化工学院，南京 210094)

Chen Long Wei Yan'an

聚乙二醇单甲醚－(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)衍生物(MPEG－DSPE)是两亲性聚合物，它在水中可形成聚合物胶束，这种胶束是一种核－壳结构，尺寸100 nm左右。其通常是用于包覆疏水性药物，以增加疏水性药物在人体血液中的溶解度从而发挥药效［1］。这种聚合物胶束还可利用聚乙二醇分子链段形成的立体位阻层阻碍人体血液内高密度脂蛋白的攻击和细胞的吞噬从而延长药物在体内的作用时间，使其不至于在达到病变部位之前被消耗［2－4］。同时这种纳米聚合物胶束利用EPR效应而具有被动靶向作用，从而使其在抗癌靶向药物中得到广泛的应用［5］。

目前抗癌靶向药物价格普遍较高，这与药物本身的原料来源和制备方法有重要关系，因此选择低成本的原料和简便的制备方法较为重要。目前报道的制备MPEG－DSPE的方法大致分为两大类，一类是直接使用MPEG与DSPE在羰基二咪唑的作用下缩合制备［6］，另一类为将MPEG的羟基转化为有较高活性的中间体活性酯，然后与DSPE的氨基反应形成酰胺键［7－8］。这些制备方法都是使用高纯度的DSPE为原料，DSPE的分子量较大且结构比较复杂，其通常采用柱层析或者全合成方法制备［9－10］，反应步骤较多，反应困难，产率较低，因此较高纯度的DSPE的价格非常昂贵，因此寻找能替代DSPE的物质具有重要意义。

大豆磷脂主要由大豆磷脂酰胆碱(SPC)和大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)组成，它是加工大豆油的一种副产物，价格便宜，其中SPE中的脂肪酸主要由油酸，亚油酸，棕榈酸，硬脂酸和亚麻酸组成，存在较多的不饱和脂肪酸，具有软化血管，降低胆固醇和降低血压的功能［11－13］。用其作为原料制备的MPEG－SPE不仅成本低于MPEG－DSPE而且更有利于人类心血管的健康。因此研究采用工业级大豆磷脂和MPEG2000为原料制备大豆磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇单甲醚2000(MPEG2000－SPE)。由于反应是大分子之间进行的，为了尽可能提高反应的转化率，我们设计将MPEG2000氧化为聚乙二醇单甲醚2000羧基衍生物(CMPEG2000)，而后制备成高活性的聚乙二醇单甲醚2000酰氯。由于大豆磷脂是一种混合磷脂不仅有SPE还含有游离的脂肪酸和其他的磷脂，为此首先采用丙酮萃取的办法将大豆磷脂中的游离脂肪酸除去，然后利用MPEG及其衍生物(包括MPEG－SPE)在无水乙醚中不溶解的特性将未参与反应的磷脂除去。反应过程中将产生三乙胺的盐酸盐，利用其在四氢呋喃中不溶解的特性将其分离，干燥称重，用来表征聚乙二醇单甲醚2000酰氯的转化率。具体过程见图1。

图1 MPEG－SPE的制备过程图

1 材料与方法

1.1 试验仪器

AVANCE(III)500MHz型核磁共振仪(DMSO为溶剂，TMS为内标):瑞士 Bruker;Nicolet iS1O FTIR型红外光谱仪:赛默飞世尔科技公司;FL3－TCSPC荧光光谱仪:法国 HoribaJobinYvon;MPEG(Mn=2 000):海安石油化工厂;三氧化铬:上海凌峰化学试剂有限公司;工业大豆磷脂:广州倚得磷脂有限公司。

1.2 大豆粉末磷脂的制备

工业级大豆磷脂含有一定量的游离脂肪酸，应当在反应进行前除去，过程:称取12 g大豆磷脂加入到100 mL丙酮中，搅拌至固体出现，减压抽滤，滤饼加入到2支20 mL离心管中，分别加入10 mL丙酮，在4 000 r/min的转速下离心2 min，倒出液体，重复多次，直至离心管中液体无色时，取出离心管中固体，放入真空干燥箱中室温干燥24 h。

1.3 CMPEG2000 的制备

参照文献［14］。

1.4 聚乙二醇单甲醚2000酰氯的制备

称取2 g CMPEG2000加入到10 mL二氯甲烷中，再向反应体系中加入20 mL二氯亚砜［15］，回流反应6 h。减压蒸馏，加入无水乙醚沉淀，抽滤，得到白色固体。

1.5 MPEG2000－SPE的制备

分别称取 4.0、4.6、5.2、6.0、6.8、7.2 g 大豆粉末磷脂溶解到30 mL三氯甲烷中，移入到150 mL的三口烧瓶中，加入3 mL的三乙胺，磁力搅拌，升温到45℃，将2 g聚乙二醇单甲醚2000酰氯溶解到20 mL三氯甲烷中，使用滴液漏斗逐滴加入到三口烧瓶中。反应4 h。反应结束后，旋蒸除去三氯甲烷和未反应的三乙胺。再加入50 mL四氢呋喃沉淀出三乙胺的盐酸盐，离心分离，离心管底部固体干燥后称重，用于计算聚乙二醇单甲醚2000酰氯的转化率。上层液体旋蒸除去四氢呋喃再加入无水乙醚沉淀出未反应的聚乙二醇单甲醚2000酰氯和MPEG 2000－SPE，干燥称重。

2 结果与讨论

2.1 结构分析

图2和图3为m(大豆粉末磷脂)∶m(羧基化聚乙二醇单甲醚)=3∶1时产物的红外和核磁谱图。IR:1 650 cm－1(—C(O)NH—的羰基伸缩振动峰)，1 533 cm－1(—C(O)NH—的氨基面内弯曲振动峰)，1 100 cm－1(C—O—C伸缩振动峰)1HNMR(DMSO d6):δH=0.83(—CH3，a)，1.21 ～1.28(脂肪酸上的饱和碳—CH2，b)，1.47(—CH2—CH2—COOR，c)，1.98(—CH2—CC，d)，2.07(—NH—C(O)—CH2，e)，2.25(—CH2—COOR，f)，2.72(CC—CH2—CC，g)，3.2(O—CH3，h)，3.3 －3.8(重复单元—CH2—CH2—O—，i)，3.85(—P—O—CH2—CH2，j)，4.01(—CH2—O—P(O)—，k)，4.12(—NH—C(O)—，l)，4.17(P(O)—O—CH2，m)，4.25(CH2—CH—CH2—，n)，5.05(CH2—CH—CH2—，o)，5.31(—CH CH—，p)。

图2为产物的红外谱图，将大豆粉末磷脂和CMPEG的红外谱图进行比较，可以看出大豆粉末磷酯的红外谱图中1 616 cm－1处出现的是伯氨基的剪式振动。CMPEG的红外谱图中1 100 cm－1处出现的是C—O—C的伸缩振动峰，产物的红外谱图中出现的1 650 cm－1处的峰是形成的酰胺键的羰基蜂，在1 533 cm－1处出现的是仲酰胺的氨基峰，而在1 616 cm－1处出现的吸收峰消失，并且在1 100 cm－1处出现了C—O—C的伸缩振动峰，由此证明MPEG－SPE的生成。图3为产物的核磁谱图，产物在无水乙醚中进行多次离心分离，完全除去了未反应的脑磷脂和卵磷脂，而从产物的核磁谱图中可以看到磷脂的特征位移表明MPEG分子链已经与SPE发生了反应，因此从IR和1HNMR谱图中证实反应产物含有MPEG－SPE。

图2 MPEG－SPE的IR谱图

图3 MPEG－SPE的1 HNMR谱图

2.2 反应物料最佳的质量比

图4为反应物料质量比对聚乙二醇单甲醚2000酰氯转化率的影响。聚乙二醇单甲醚2000酰氯转化率通过产生的三乙胺盐酸盐的质量表述，方法如下:

结果表明，当m(大豆粉末磷脂)∶m(羧基化聚乙二醇单甲醚)=3∶1，产物转化率为85.2%，达到最佳工艺条件。

图4 反应物料质量比对聚乙二醇单甲醚2000酰氯转化率的影响

2.3 MPEG2000－SPE的胶束粒径

MPEG2000－SPE是一种聚合物表面活性剂，当其在水中浓度大于临界胶束浓度时可形成以疏水链端为核，亲水链端为核的纳米胶束，可以用来运输药物，当其达到一定的纳米尺寸时具有靶向特性。本部分采用透射电子显微镜测定MPEG2000－SPE的胶束粒径，方法如下:称取一定量的MPEG2000－SPE溶解于水中，常温放置3 h，使得MPEG2000－SPE在水中形成稳定的胶束，滴到铜网上，铜网在室温下干燥后，加入1%磷钨酸水溶液负染，干燥后在透射电镜上观察胶束的大小，结果如图5所示。试验结果表明，MPEG2000－SPE的胶束呈球形，粒径为30～80 nm。

图5 MPEG2000－SPE胶束的TEM照片

2.4 MPEG2000－SPE热力学稳定性研究

MPEG2000－SPE在水溶液中可形成胶束，胶束热力学的稳定性指的是聚合物胶束向单体解聚时的浓度，即临界胶束浓度(CMC)。本试验采用灵敏度较高的荧光探针技术来测定MPEG2000－SPE的CMC。方法参照文献［16］。结果如图5所示。当x= －5.69时，I384/I373的值发生突变，说明此时已到达CMC，临界胶束浓度为2×10－6mol/L，小于小分子的临界胶束浓度10－3mol/L，因此MPEG－SPE的热力学稳定性优于小分子胶束。

图6 MPEG－SPE浓度对I384/I373值的影响

2.5 MPEG2000－SPE胶束动力学稳定性研究

聚合物胶束的稳定性通常由热力学稳定性和动力学稳定性评价，其中动力学稳定性是指胶束分解为单体的速度，设计由正己烷和水形成的乳状液体系，根据乳状液分离一定体积的液体来表征胶束分解为单体的速度，同等条件下与大豆粉末磷脂进行对比。操作步骤:用50 mL的蒸馏水溶解0.05 g试样，置于100 mL的具塞量筒内，量取50 mL正己烷，塞上盖子猛烈振动至充分乳化后，立即测定水－油相分开10 mL所耗费的时间。试验结果表明:MPEG2000－SPE分开10 mL所用时间为183 s，远远大于大豆粉末磷脂所用时间6 s，并且当MPEG 2000－SPE的乳液分出41 mL体积后油－水不再分离，量筒上部呈现稳定的凝胶状态。因此MPEG 2000－SPE的动力学稳定性优于大豆粉末磷脂。

表1 不同物质的油水两相分开体积与所用时间之间的关系/s

3 结论

3.1 以MPEG2000和大豆粉末磷脂制备了MPEGSPE，产物经IR和1HNMR进行了确证。

3.2 探讨了反应物料投料质量比对聚乙二醇单甲醚2000酰氯转化率的影响，结果表明当m(大豆粉末磷脂)∶m(聚乙二醇单甲醚2000酰氯)=3∶1时，产物转化率为85.2%，达到最佳工艺条件。

3.3 采用透射电子显微镜测定MPEG2000－SPE的胶束粒径，试验结果表明，MPEG2000－SPE的胶束呈球形，平均粒径在30～80 nm左右，粒子较均匀。

3.4 采用荧光探针法测定MPEG2000－SPE的临界聚集浓度以表征其胶束在水溶液中的热力学稳定性，试验结果表明 MPEG－SPE临界聚集浓度为2×10－6mol/L，小于小分子的临界胶束浓度 10－3mol/L，因此MPEG－SPE的热力学稳定性优于小分子胶束。

3.5 通过测定MPEG2000－SPE对正己烷和水形成的乳状液的稳定性表征MPEG2000－SPE胶束的动力学稳定性。试验结果表明，MPEG2000－SPE分开10 mL所用时间为183 s远远大于大豆粉末磷脂所用时间6 s，并且当MPEG－SPE的乳液分出41 mL体积后油－水将不再分离，量筒上部呈现稳定的凝胶状态。因此MPEG－SPE的动力学稳定性优于大豆粉末磷脂。

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