羊黑疫单价疫苗的研制及免疫家兔血清抗体测定

张西云，李生庆，李志宁，范玉霞，尼 玛，何生德，黄 荣，胡国元，王亭亭，刘怀新，祁 果

（1.青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁810016；2.青海省海晏县兽医站，青海 海晏812200；3.青海省海晏县青海湖乡兽医站，青海 海晏812200）

羊黑疫又称传染坏死性肝炎，羊的一种急性 高度致死性毒血症，特征是肝实质坏死病灶，绵羊、山羊均可发生。2006年以来，在海北地区多个县发生羊急性死亡，2008年9月青海省海晏县甘子河乡尕海村牧户扎西饲养的羊群发生急性死亡，饲养300余只，陆续死亡40余只；2008年11月份，海晏县三角城镇李×购入1～1.5岁公母羊300余只育肥，购入后该羊群注射羊四联苗。1个月后羊群中出现急性死亡的羊只，到元月份绵羊出售前共死亡羊60余只；2010年9月底，青海湖乡同宝村东周才郎饲养绵羊700余只，到12月止陆续死亡成年绵羊100余只，至2011年5月份仍然有零星死亡，主要以成年母羊为主，最终死亡160余只。上述羊群均已注射羊黑疫疫苗。鉴于上述情况，试验利用本室保存的羊黑疫菌株，结合C61-4标准菌株，进行了羊黑疫单价疫苗的研制及家兔免疫试验。

1 材料与方法

1.1 菌株 B型诺维梭菌制苗菌株C61-4，地方分离株TB05。

1.2 培养基制备 基础液为肉肝胃酶消化液（本实验室自制），VF培养基（1.0%䏡胨、0.5%酵母浸膏、1.0%葡萄糖、调pH值到8.4，分装后上覆石蜡油，115℃，40min高压灭菌后待用）。

1.3 疫苗制备

1.3.1 细菌培养

1.3.1.1 种子培养 将C61-4菌株和TB05株分别接种于未加生肝的VF培养基中，37℃温箱中培养72 h后取出待用。

1.3.1.2 大瓶培养 将上述种子按5%的比例接种至高压灭菌后的培养基中，37℃温箱中培养72 h。分别吸取分离株氢氧化铝苗和C61-4磷酸铝苗5mL，4 000 r/min离心20min，按比例稀释后静脉注射体重18～20 g小鼠，观察小鼠死亡情况。

1.3.2 菌苗制备

1.3.2.1 菌液脱毒、杀菌 菌液培养72 h，按0.5%的剂量加入甲醛，密闭（之前应充分振荡，并注意排气），置于37℃杀菌、脱毒72 h，每天充分摇振2次。

1.3.2.2 无菌检验 分别吸取分离株培养液和C61-4分离株培养液接种至加生肝的VF培养基、普通肉汤、普通斜面各两支，每支接0.5mL，37℃温箱中培养1周，观察有无杂菌。

1.3.2.3 脱毒检验 72 h后分别吸取分离株培养液和C61-4株培养液5 mL，4 000 r/min离心20 min，原液静脉注射体重18～20 g小鼠0.2mL，观察小鼠死亡情况。

1.3.2.4 菌苗配制 将脱毒菌液用铜纱网滤吸至分别加有2 000mL氢氧化铝胶、磷酸铝胶及明矾佐剂溶液瓶中至10 000mL刻度，即菌液4份+铝胶1份，每毫升菌苗含氢氧化铝7mg，按0.01%的量加入1%硫柳汞100mL，充分混合后，分装。

1.3.3 菌苗无菌、安全性检验

1.3.3.1 无菌检验 菌苗分别接种普通斜面、普通肉汤、厌气肝汤各两管，每管接种0.5mL。另用100mL肉汤和100mL厌气肝汤各1瓶，分别接种菌苗0.5mL，培养7 d后，分别自肉汤瓶和厌气肝汤瓶吸取适量培养物，移植于普通斜面和普通肉汤各1支，37℃共培养14 d，观察有无细菌生长。

1.3.3.2 安全性检验 取体重1.5～2 kg健康兔4只，TB05株氢氧化铝苗和C61-4磷酸铝苗分别肌肉注射疫苗5 mL，观察有无局部或全身异常反应，连续观察4周。

1.3.4 家兔免疫试验 取体重1.5～2 kg健康兔44只，按菌株和赋形剂不同分为分离株氢氧化铝苗、磷酸铝苗和明矾苗，C61-4磷酸铝苗，免疫剂量分为0.1mL和0.5mL，每1免疫剂量皮下注射家兔4只，对照组各2只。免疫21 d后，按家兔最小致死量300 MLD/mL攻毒。观察记录家兔死亡情况。

1.3.5 血清抗体效价测定

1.3.5.1 血清采集 上述免疫家兔免疫21 d后，耳中动脉采血，在4℃冰箱过夜，待血清析出后，按组别吸出血清待用。

1.3.5.2 中和毒素制备 将培养液500 mL 5 000 r/min离心20 min，上清用正压滤器过滤除菌，用体重18～20 g小鼠静脉注射测定毒价。

1.3.5.3 中和试验 将上述毒素抗原递倍稀释到相应滴度，不同毒素含量分配到不同的稀释管中，每管加入血清0.1mL，37℃作用50min后，吸0.2mL给小鼠静脉注射，观察、记录死亡情况。

2 结论

2.1 菌液培养毒素测定 分离株培养液经离心18～20 g小鼠静脉测毒，其毒力为2万MLD/mL，C61-4标准菌株毒力为1.5万MLD/mL。

2.2 菌液杀菌、脱毒 用0.5%甲醛溶液37℃72 h即可杀菌、脱毒彻底。

2.3 菌苗安全性试验 分离株氢氧化铝苗和C61-4磷酸铝苗分别肌肉注射疫苗5mL，连续观察4周，局部或全身均无异常反应，安全性良好。

2.4 效力检验

2.4.1 不同菌株、不同免疫剂量家兔免疫效果试验 对照兔，静脉注射300MLD毒素，2/2死亡，即1个家兔MLD=300小鼠MLD。TB05株磷酸铝苗0.5mL免疫组最高可抵抗200个MLD（家兔最小致死量），而C61-4磷酸铝苗最高只能抵抗100个MLD；分离株磷酸铝苗0.1mL免疫组最高可抵抗200个MLD，而C61-4株最高只能抵抗低50个MLD（结果见表1和图1）。

表1 不同菌株、不同赋形剂羊黑疫单价苗家兔免疫攻毒试验

图1 不同菌株、不同免疫剂量家兔免疫效果比较

图2 不同赋形剂、不同免疫剂量家兔免疫效果比较图

2.4.2 不同赋形剂、不同免疫剂量家兔免疫效果试验 TB05株氢氧化铝苗、磷酸铝苗及明矾苗0.1 mL免疫组免疫21 d后，保护力分别为200、200、100 MLD（家兔最小致死量）、0.5mL组免疫组保护力均为200MLD（结果见表1和图2）。

2.5 血清抗体测定

2.5.1 不同菌株、不同免疫剂量免疫家兔血清抗体效价测定结果 对照小鼠2个MLD即可致死。TB05株磷酸铝苗0.5mL免疫组0.1ml血清最高可中和300个MLD（小鼠最小致死量），而C61-4最高只能中和100个MLD；TB05株磷酸铝苗0.1mL免疫组0.1mL血清最高可中和200个MLD（家兔最小致死量），而C61-4最高只能中和100个MLD（结果见表2和图3）。

表2 羊黑疫单价苗免疫家兔血清抗体中和力测定

图3 不同菌株、不同免疫剂量免疫家兔血清抗体效价比较

2.5.2 不同赋形剂、不同免疫剂量免疫家兔血清抗体测定结果 TB05株氢氧化铝苗、磷酸铝苗及明矾苗0.1mL免疫组免疫21 d后，0.1mL血清中和力分别为300、200、100MLD（小鼠最小致死量）、0.5mL组免疫组0.1mL血清中和力分别为400、300、300MLD；（C61-4）磷酸铝苗0.1mL和0.5mL免疫组免疫21 d后，0.1 mL血清中和力均为100MLD（结果见表2和图4）。

3 讨论

图4 不同赋形剂、不同免疫剂量免疫家兔血清抗体效价比较

3.1 制备浓度高、活性和抗原性强的外毒素是制备高质量类毒素疫苗的前提，这不仅取决于细菌菌株,还与培养基组成、培养时间、温度等条件密切相关[1]。本试验中所采用的制苗用菌株和培养基均是本实验室通过前期研究筛选而得，该分离菌株在此培养基上产毒平均可达2万MLD/mL，最高可达4万MLD/mL，产毒能力为羊黑疫苗制造规程规定的0.2～1万MLD/mL最低毒价[2]的10倍以上。这对于制备高浓度毒素抗原提供了必要的保障。

3.2 甲醛溶液具有还原作用，它能抑制蛋白质活性，目前对外毒素灭活常用的化学物质仍是甲醛，其灭活效果主要与甲醛的浓度、温度、作用时间和pH值有关，虽然采用高浓度的甲醛和高温灭活，能使其灭活时间减少，但对抗原的损失也很大[3]。本试验中，用0.5%甲醛，在37℃条件下对外毒素灭活72 h即可达到脱毒杀菌的效果。安全性试验中，注射5mL菌苗的家兔体重2个月的观察期内从最初的2.43 kg增长到2.58 kg。表明该菌苗对动物的生长影响很小。

3.3 在不同赋形剂、不同免疫剂量免疫家兔免疫效果比较试验中，分离株磷酸铝苗0.5mL免疫组3种赋形剂菌苗免疫效果无差别，均为200 MLD/mL家兔最小致死量，而0.1mL免疫组免疫效果磷酸铝苗免疫效果最好，可达200MLD/mL家兔最小致死量，氢氧化铝苗和明矾苗仅为100MLD/mL家兔最小致死量。通过不同菌株、不同免疫剂量家兔免疫效果试验，发现分离株磷酸铝苗0.5mL免疫组家兔免疫效果（可抵抗200MLD/mL家兔最小致死量的毒素）和0.1 mL免疫组家兔免疫效果（可抵抗200MLD/mL家兔最小致死量的毒素）均高于标准菌株C61-4磷酸铝苗0.5mL免疫组免疫效果（100MLD/mL家兔最小致死量的毒素）和0.1 mL免疫组免疫效果（100 MLD/mL家兔最小致死量的毒素）。上述试验结果表明，3种赋形剂羊黑疫单价苗中，磷酸铝苗家兔免疫效果最好，分离株磷酸铝苗免疫效果优于标准株磷酸铝苗。

3.4 通过不同菌株、不同免疫剂量家兔免疫效果试验，发现TB05株磷酸铝苗0.5mL免疫组家兔免疫血清中和抗体（0.1mL血清可中和300 MLD/mL小鼠最小致死量的毒素）和0.1mL免疫血清中和抗体（0.1 mL血清可中和200 MLD/mL）均高于C61-4磷酸铝苗0.5mL和0.1mL家兔免疫血清中和抗体量（0.1mL血清中和100MLD/m）。不同赋形剂、不同免疫剂量免疫家兔血清抗体效价比较试验，TB05株磷酸铝苗0.5mL免疫组氢氧化铝苗血清中和效价最高，0.1mL血清可中和400 MLD/mL（小鼠最小致死量）、磷酸铝苗和明矾苗0.1mL血清可中和300MLD/mL；0.1mL免疫组血清中和效价氢氧化铝苗最高，0.1 mL血清可中和300 MLD/mL，磷酸铝苗次之，可中和200 MLD/mL，明矾苗最低，可中和100MLD/mL。血清中和试验结果表明，3种赋形剂单价苗免疫家兔后，其血清抗体中和能力氢氧化铝苗最高，其次为磷酸铝苗和明矾苗；TB05株磷酸铝苗血清中和能力优于标准株磷酸铝苗。

3.5 结合上述试验，用分离株制备菌液，采用0.5%甲醛溶液37℃作用72 h杀菌脱毒后，用磷酸铝胶作为赋形剂，制备成羊黑疫磷酸铝苗免疫家兔，其免疫效果和血清抗体中和效价均优于标准菌株羊黑疫磷酸铝苗，故该分离菌株和磷酸铝苗制作方法可用于羊黑疫单价疫苗的研制。

志谢：本次试验承蒙本院张生民研究员的悉心指导，以及课题组成员的大力帮助。

[1]柴同杰，刘文波.魏氏梭菌毒素疫苗研制及其免疫家兔抗体消长规律[J].中国兽医学报，2005（5）：259-262.

[2] 范克锁.魏氏梭菌B毒素的提纯[J].中国畜禽传染病，1990（1）：46-50.

[3]王明俊.兽医生物制品学[M].北京：中国农业出版社，1995：341-345.