绵羊肺炎支原体p128基因序列分析及原核表达

冯旭飞，刀筱芳，张贤宇，李定霏，杨发龙

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都610041；2.成都市水生动物检疫检验站，四川 成都610071）

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）是引起绵羊、山羊特别是羔羊增生性间质性肺炎的主要病原。此外，羊感染绵羊肺炎支原体后，对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌以及副流感病毒等病原的易感性增加[1-3]。该病原在全球范围内均有分布，在我国流行也十分广泛，给养羊业造成了较大的经济损失。

粘附素是支原体主要的毒力因子和免疫原，其介导支原体对宿主靶细胞的粘附和致病过程，同时也可诱导机体产生特异性免疫应答。因此，支原体的粘附素已经成为建立ELISA等血清学诊断技术和开发重组亚单位疫苗的重要候选蛋白分子。Niang等人的研究已表明，绵羊肺炎支原体同样可以粘附到呼吸道上皮细胞，导致纤毛运动停滞，进一步造成纤毛破坏和脱落[4]。但目前对绵羊肺炎支原体中与粘附功能相关的分子尚不清楚。基于16S rRNA基因和HSP70基因的遗传进化分析表明，绵羊肺炎支原体与猪肺炎支原体具有最为相近的亲缘关系[5-6]。在猪肺炎支原体中，P97是最为重要的粘附素分子。P146是P97/P102家族成员之一，研究已表明其同样可以粘附猪气管纤毛，是另一重要的粘附分子，同时也是主要的免疫原之一[7]。在绵羊肺炎支原体SC01株基因组中[8]，经分析，发现一编码产物与猪肺炎支原体p146高度同源的基因，推测其编码蛋白的分子量为128 ku，故暂命名为P128蛋白。为了深入研究该蛋白的功能，本研究在对其进行基因序列分析的基础上，进行了原核表达，旨在为下一步深入研究其功能以及开发血清学诊断技术和亚单位疫苗提供有用的试验数据。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及血清 绵羊肺炎支原体SC01株由本实验室（西南民族大学动物医学实验室）分离鉴定和保存；pMD19-T载体、TOP 10、JM109、Rosetta（DE 3），均购自宝生物工程（大连）有限公司产品；pET-41 a（+）载体为Novagen公司产品；兔抗绵羊肺炎支原体SC01株阳性血清及阴性血清均由本实验室制备。

1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司产品；AxyPrepTMDNAGel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit均为Axygen公司产品；Histrap HP重组蛋白纯化柱为GE Healthcare公司产品；Immun-Star WesternC Chemiluminescence Kit为Bio-Rad公司产品。1.3 p128基因序列分析 核苷酸及氨基酸序列的同源性比较和分析采用NCBI的BLAST工具；蛋白跨膜区、信号肽及脂蛋白预测分别利用在线工具TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SigalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）以及（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）完成。抗原性分析采用在线分析站点（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）进行。

1.4 引物设计 根据绵羊肺炎支原体SC01株p128基因序列，采用Primer Premier 6.0软件设计了一对引物：p128 F/p128R，引物扩增片段大小为546 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其序列如下：

P128 F：5′-CGGGATCCTTAATATTAGCATTGACC-3′（下划线为BamH I酶切位点）；

P128 R：5′-CCCAAGCTTCACTAAAATCTGTT CTTCT-3′（下划线为Hind III酶切位点）。

1.5 目的片段的PCR扩增 采用常规酚/氯仿法提取绵羊肺炎支原体SC01株基因组DNA作为模板，利用上述引物P128 F/p128R进行PCR扩增。反应总体系为25μL，包含10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP（各2.5mmol/L）2μL、MgCl2（25mmol/L）2μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.125μL、DNA模板2μL用无菌水补足25μL。反应条件为：95℃5min；94℃30 s，58℃45 s，72℃45 s，35个循环；72℃10min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6 原核表达载体的构建 将PCR扩增的p128基因与pMD19-T载体连接，连接产物转化TOP 10，提取重组质粒进行鉴定，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序并将重组质粒命名为pMDp128。将测序正确的pMD-p128以及pET-41（a+）载体分别用Bam H I和Hind III双酶切，胶回收目的片段，连接转化到JM109，经菌液及PCR鉴定为阳性的送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.7 重组蛋白的诱导表达、可溶性分析 将上述鉴定正确的重组阳性质粒pET-41（a+）-p128转化至表达工程菌E.coli Rosetta（DE3）中，挑选阳性菌落接种到LB肉汤中培养至OD600nm为0.6后，加入0.2 mmol/L的IPTG进行诱导表达3 h，并采用超声破碎仪进行超声裂解。用SDS-PAGE对重组蛋白表达情况及其可溶性进行电泳分析。

1.8 Western-blot分析 按照包涵体纯化方法对重组蛋白进行纯化，以1∶300稀释的一抗（兔抗绵羊肺炎支原体阳性血清）和1∶5 000稀释的二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG）按照Western blot操作方法进行重组蛋白的鉴定。

2 结果

2.1 分子特征分析 对p128基因进行序列分析结果表明，p128基因CDS全长3 426 bp，G+C含量为31.03%，其中含3个TGA密码子（在支原体基因组中上编码色氨酸），分别位于1 999 bp、2 356 bp、2 740 bp碱基处。该基因共编码1 141个氨基酸，核酸分子量为128 484.5，其蛋白分子量为127.95 kDa。经BLAST比较分析，p128基因与猪肺炎支原体黏附素基因p146相似性最高，两者间核苷酸序列的相似性为73%，氨基酸序列的相似性为53%。

TMHMM、SignlP 4.0和LipoP 1.0在线工具分析的结果表明，P128蛋白主要锚定于细胞膜外，在其N端7-29氨基酸之间，有一明显的跨膜区螺旋（图1），无非脂蛋白信号肽（图2），在第23-24氨基酸之间出现一个脂蛋白信号肽酶裂解位点。抗原表位分析显示，P128蛋白包含丰富的抗原表位，通过预测发现其包含35个可能的抗原表位。平均抗原趋向性为1.0075。

图1 P128跨膜结构分析

图2 P128脂蛋白分析

2.2 绵羊肺炎支原体p128基因的扩增结果 绵羊肺炎支原体p128基因的PCR扩增片段在546 bp左右出现一条特异性条带，该片段与预期的目的条带大小相符，阴性对照未出现扩增（图3）。

图3 PCR扩增结果

2.3 原核表达载体的构建及鉴定 重组质粒经双酶切鉴定与预期结果一致，质粒PCR扩增获得特异性条带（图4）表明表达载体构建正确。

图4 重组质粒的PCR鉴定

2.4 重组蛋白的表达和可溶性分析 对重组蛋白进行电泳分析，结果显示，经IPTG诱导后在50 ku～75 ku之间出现明显的表达条带，其大小与预期（54.83 ku）相符（图5）；该重组蛋白以包涵体形式进行表达（图6）。

2.5 Western-blot分析结果 Western-blot检测结果表明，重组蛋白可与绵羊肺炎支原体阳性血清特异性结合，而阴性血清无条带（图7）。表明P128蛋白具有良好的反应原性。

图5 P128的诱导表达

图6 表达产物的可溶性分析及纯化

图7重组蛋白的Western blot分析

3 讨论

与丝状支原体簇成员等其他羊致病性支原体相比，绵羊肺炎支原体分子生物学特性方面的研究相对滞后，其毒力因子及重要免疫原蛋白的研究尚不够深入。此前国内外多个学者先后采用双向电泳、SDS-PAGE以及免疫印迹等方法对绵羊肺炎支原体的免疫原蛋白组成和大小进行了初步分析[9-10]。针对特定的功能蛋白和编码基因及其结构和功能的研究相对较少。

Bogema等人[7]对猪肺炎支原体p146进行原核表达后获得重组P146蛋白并进行粘附试验，经多次重复，证明P146是一个具有多种功能的粘附素；同时证实，P146蛋白可以与免疫动物、耐过动物以及人工感染动物的血清均可以发生明显的结合反应，说明在这些血清中存在P146的抗体，从而证明P146是良好的免疫原。本文对绵羊肺炎支原体p128基因序列的分析结果表明，P128蛋白的编码基因与猪肺炎支原体粘附素蛋白P746的基因高度同源，两者间核苷酸序列的相似性为73%，编码氨基酸序列的相似性为53%，说明p128为p146的直系同源基因。为研究该蛋白的功能，本研究对编码绵羊肺炎支原体p128的部分基因片段进行了克隆，并成功在大肠杆菌中以包涵体的形式得到表达。利用兔抗绵羊肺炎支原体全菌抗体进行免疫印迹分析，结果显示，纯化得到的重组蛋白能与兔抗全菌抗体特异性结合，表明用绵羊肺炎支原体免疫家兔后，家兔能产生针对P128蛋白的抗体，提示P128是绵羊肺炎支原体的免疫原之一；这同时也说明本研究所表达的重组蛋白可以作为抗原，在ELISA等绵羊肺炎支原体血清抗体检测试剂盒的研制和亚单位疫苗的开发等方面具有潜在的应用价值。但P128在绵羊肺炎支原体中是否也是参与粘附过程的一个粘附素有待进一步的研究。

[1] Rifatbegovic M，Maksimovic Z，Hulaj B.Mycoplasma ovipneumoniae associated with severe respiratory disease in goats[J].Vet Rec，2011，168（21）：565.

[2] Dassanayake R P，Shanthalingam S，Herndon C N，et al.Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatal Mannheimia haemolytica pneumonia[J].Vet Microbiol，2010，145（3-4）：354-359.

[3] Sheehan M，Cassidy J P，Brady J，et al.An aetiopathological study of chronic bronchopneumonia in lambs in Ireland[J].The Veterinary Journal，2007，173（3）：630-637.

[4] Niang M，Rosenbusch R F，Debey M C，et al.Field isolates of Mycoplasma ovipneumoniae exhibit distinct cytopathic effects in ovine tracheal organ cultures[J].Zentralbl Veterinarmed A，1998，45（1）：29-40.

[5]Pettersson B，Uhlén M，Johansson K E.Phylogeny of somemycoplasmas from ruminants based on 16S rRNA sequences and definition of a new clusterwithin the hominis group[J].Int JSyst Bacteriol，1996，46（4）：1093-1098.

[6] LIM，Ma C J，Liu X M，et al.Molecular cloning of HSP70 in Mycoplasma ovipneumoniae and comparison with that of othermycoplasmas[J].GenetMol Res，2011，10（2）：834-848.

[7] Bogema D R，Deutscher A T，Woolley L K，et al.Characterization of Cleavage Events in the Multifunctional Cilium Adhesin Mhp684（P146）Reveals a Mechanism by Which Mycoplasma hyopneumoniae Regulates Surface Topography[J].M BIO，2012，3（4)）：1-11.

[8]Yang F L，Tang C，Wang Y，etal.Genome Sequence of Mycoplasma ovipneumoniae Strain SC01[J].Journal of Bacteriology，2011，193（18）：5018.

[9]许健，储岳峰，高鹏程，等.我国17株绵羊肺炎支原体分子分型及其菌体蛋白免疫印迹[J].微生物学报，2011，51（10）：1421-1426.

[10]Parham K，Churchward C P，Mcauliffe L，et al.A high level of strain variation within the Mycoplasma ovipneumoniae population of the UK has implications for disease diagnosis and management[J].VetMicrobiol，2006，118（1-2）：83-90.