猪干扰素α质粒-PLL聚合体对猪PRRSV弱毒疫苗免疫增强作用研究

杨竹鸣，陈善真，李其昌，刘小琴，王贵平，范红结，李中圣

（1.广东海大畜牧兽医研究院，广东 广州510630；2.南京农业大学，江苏 南京210095）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种恶性传染病，该病发病率高、传播快，严重危害养猪业的发展。PRRSV感染机体引起的免疫抑制和持续性感染一直是PRRS防控的难点。目前，PRRS主要的预防手段仍然是注射疫苗，无论是PRRSV灭活苗还是弱毒疫苗，不能刺激体内产生强烈的清除病毒的免疫反应，只能通过诱导产生高滴度中和抗体限制PRRSV的继续感染。细胞因子具有免疫佐剂效应，诸多研究表明，细胞因子可在不同程度上增加灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗，以及核酸疫苗的免疫效应[1]。IFNα属于Ⅰ型干扰素，主要是通过对Th1细胞和巨噬细胞的调节和对MHC I类分子的诱导表达起调节作用[7]。由于PRRSV具有免疫抑制的病毒感染机制，在PRRSV免疫中，配合可提高机体T淋巴细胞分化作用的细胞因子佐剂可明显改善疫苗免疫效力[3-8]。猪IFNα（PIFNα）在兽医临床中的应用研究证明，肌肉注射PIFNα表达质粒，质粒被肌肉细胞摄取后，重组蛋白的分泌表达效率极低。为使质粒DNA在体内高效表达，学者们已做了许多关于免疫途径研究，通过基因枪注射质粒或者将质粒注射到淋巴结中来提高质粒在体内的表达效率，但是仍然没有很好的解决提高质粒在体内表达效率的问题。本试验首先将重组质粒pVAX1-PIFNα与一种阳离子多聚体-PLL聚合为：PLL-pVAX1-PIFNα，然后利用PLL-pVAX1-IFNα联合PRRSV弱毒疫苗对猪进行免疫，通过检测PRRSV中和抗体水平评估重组PIFNα对PRRSV弱毒疫苗的增强作用；通过细胞试验，验证了质粒复合物对猪外周血淋巴细胞的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料 真核表达重组质粒：pVAX1-PIFNα，由我实验室构建保存；阳离子多聚体：PLL（多聚赖氨酸），为Sigma公司产品。8周龄长白猪，经ELISA检测PRRSV抗体阴性。高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗JXA1-R株（20头份），广东某疫苗公司产品。猪IFN-γ检测试剂盒，购自上海科兴商贸有限公司；猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）中和抗体ELISA检测试剂盒，为法国LSI专业诊断试剂。

1.2 pVAX1-PIFNα质粒与PLL的聚合 方法：1 mL的浓度为969.1 ng/μL的pVAX1-PIFNα质粒与1mL的浓度为1 ng/μL的PLL混合备用，即1.938 μg的pVAX1-PIFNα质粒与0.4μg的PLL混合，凝胶电泳法验证复合效果。

1.3 细胞试验 60日龄健康猪，前腔静脉采血50mL，抗凝处理，抗凝血中加入红细胞裂解液冰浴中裂解，弃掉上清，加入高压灭菌的PBS清洗细胞3次，最终用12 mL 1640培养液重悬细胞。细胞稀释后加入12孔细胞培养板中，细胞密度为1×106/well。

按照Lipofectamine 2000使用说明分别做以下3组转染试验。A组：PLL-pVAX1-PIFNα；B组：pVAX1-PIFNα；C组：pVAX1空白质粒（阴性对照），每组4个重复，置于CO2培养箱中37℃培养，分别在12、24、48 h取细胞培养液，ELISA法检测细胞培养液中PIFN-γ的表达水平。

1.4 动物免疫 挑选20头30日龄RRSSV抗体阴性猪，分为4组，每组5头。如表1，1-3组设置为免疫组，第4组注射生理盐水，作为空白对照组，注射后各组隔离养殖。免疫用PRRSV疫苗为：PRRSV JXA1-R株弱毒苗。所有试验猪均采取耳后颈部注射。

表1 分组情况

分别在免疫前、免疫后第8、16、24、31、44天于猪前腔静脉采血，分离血清，用法国ELISA检测试剂盒检测PRRSV中和抗体。

2 结果

2.1 细胞试验中IFN-γ的检测 经ELISA法检测，检测到在细胞试验第12、24、48小时，加PLLpVAX1-PIFNα的A组检测到的IFN-γ的量均显著高于加pVAX1-PIFNα的B组（P＜0.05），对照组的中和抗体水平未见明显变化（如图1）。

图1 T细胞分泌的IFN-γ的检测

2.2 免疫猪的中和抗体水平的检测 本试验中（如图2），经检测，疫苗免疫后第8天尚未产生PRRSV中和抗体，在免疫后第16天中和抗体开始升高。在免疫检测的44 d内，PLL-pVAX1-PIFNα注射组的抗体水平显著高于其他3组（P＜0.05）；pVAX1-PIFNα注射组的中和抗体水平与只注射PRRSV弱毒苗组的水平相当，说明pVAX1-PIFNα质粒未明显提高免疫水平；对照组的中和抗体水平未见明显变化。

3 讨论

图2 PLL对机体免疫反应的作用

近几年，对PRRSV的研究在分子生物学方面取得了显著进展，对其感染机体引起的免疫抑制和持续性感染的分子机制也有了进一步认识。PRRSV感染引起的免疫抑制和持续性感染的主要原因非常复杂。一方面，猪感染PRRSV野毒株或机体免疫弱毒疫苗，不能刺激体内产生强烈的清除病毒的免疫反应，虽然PRRSV感染后N蛋白和M蛋白能够较早诱导机体产生抗体，但是这两种早期产生的抗体在体内外均不能有效中和PRRSV，疫苗免疫后期出现的高水平中和抗体无法清除免疫系统内部的病毒粒子。另一方面，PRRSV的病毒感染机制有效降低了体内T细胞对病毒的防御作用。研究发现，分泌IFN-γ的PRRSV特异性T细胞和高滴度中和抗体是介导强烈的杀伤病毒免疫反应的主要因素[2]。IFNα一方面具有启动细胞内抗病毒蛋白大量表达的级联反应机制，同时也可通过对Th1细胞的调节促进效应细胞分泌IFN-γ，进一步介导机体对病毒的清除作用。PRRSV不同于其他病毒，感染猪后会抑制体内IFNα的产生。对于猪IFNα的应用，已有很多报道，猪干扰素α蛋白在原核表达系统和真核表达系统中得到表达，其细胞免疫激活功能也得到验证[8-10]。然而，普遍的研究发现，蛋白形式的猪IFNα存在半衰期短、易被降解、蛋白纯化成本较高等一系列问题，为此，本文尝试直接利用PIFNα真核表达质粒配合疫苗免疫，以提高PRRSV疫苗免疫过程中的T细胞免疫水平。

本试验将pVAX1-PIFNα重组质粒与多聚赖氨酸（PLL）聚合，联合PRRSV弱毒疫苗免疫试验猪，探讨聚合体形式的猪IFNα对PRRSV疫苗免疫增强作用。PLL是一种极性较强的大分子物质，作为一种阳离子多聚物被广泛用来凝结DNA质粒，凝结为微粒状和短棒状的聚合物可以被细胞通过非特异性的和细胞受体介导的内吞作用进入细胞[11-12]。本试验利用PLL载体的聚合作用，将pVAX1-PIFNα质粒凝结为聚合物PLL-pVAX1-PIFNα。聚合体状态的PLL-pVAX1-PIFNα可降低质粒在机体内降解的进程，延长其对免疫细胞的刺激时间[13-14]。近年来，非病毒载体这一技术被广泛用于医学上肿瘤的基因治疗中[15-16]，学者们在多聚物基因载体上加上具有细胞靶向性的基团，以实现质粒DNA在指定的某类细胞中表达[17]。如果将这一技术应用到动物疾病的治疗中，将为动物医学的发展做出巨大的贡献。

研究报道，在PRRSV感染初期，在猪体内注射含猪IFNα的非复制性腺病毒载体DNA，发现外源IFNα的增加推迟了病毒血症的出现，降低了血液中病毒的滴度[18]，说明在PRRSV感染期，外源IFNα可以增强机体对PRRSV的天然免疫和获得性免疫。在本文的细胞试验中，分别应用pVAX1-PIFNα和PLL-pVAX1-PIFNα刺激猪淋巴细胞，IFNα可直接刺激IFN-γ等Th1细胞因子的激活，进而调动免疫细胞的抗原呈递作用和免疫系统对病毒的清除作用。聚合体状态的PLL-pVAX1-PIFNα可以更为有效地刺激淋巴细胞分泌IFN-γ，其原因一方面可能在于聚合体质粒不易降解，延长了质粒对细胞的作用时间；另一方面，PLL可能促进了转染试剂的效率，从而提高了细胞对质粒的摄取作用。与单纯的质粒相比，聚合体状态的PLL-pVAX1-PIFNα有效提高了PRRSV疫苗的免疫效力，这与IFNα对机体先天免疫系统的早期激活及病毒粒子的及时清除有密切关系。作者根据PRRSV活疫苗免疫现状，尝试一种在获得性免疫激活的同时加强机体先天免疫的方法，为兽用干扰素的临床应用提供了有益参考，也为功能质粒的临床应用提供了有力借鉴。

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