雷公藤多甙联合环孢素A对小鼠腹腔心脏移植急性排斥反应的影响

雷公藤多甙联合环孢素A对小鼠腹腔心脏移植急性排斥反应的影响

王远涛1，胡钰2，陈默1，周洪澜1，傅耀文1，王伟刚1*

(1.吉林大学白求恩第一医院 泌尿外二科,吉林 长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院 病理科)

器官移植仍是目前治疗终末期器官衰竭最有效的办法[1,2]。患者需通过长期服用免疫抑制药物来维持移植器官的存活及其正常功能。环孢素A(cyclosporine A，CsA)是目前临床最常见的免疫抑制剂之一,但由于患者需长期服用，毒副作用强，并且费用高昂。因此，寻找新型免疫抑制剂，降低毒性损伤，减轻患者经济负担，是目前移植领域研究的热点之一。雷公藤作为传统中药材，具有抗炎、免疫抑制作用，可以治疗类风湿性关节炎[3]等自身免疫性疾病[4]。雷公藤多甙(tripterium wilfordii hook f ，TWHF)作为雷公藤提取物，其免疫抑制功效优于雷公藤本身[5,6]。本实验使用雷公藤多甙联合环孢素A，观察对小鼠腹腔心脏移植物存活时间的影响、移植急性排斥反应的组织学变化、受体外周血CD4+和CD8+T细胞比例变化等情况，寻找新型免疫抑制方案。

1材料与方法

1.1实验动物

近交系C57BL/6、BALB/C小鼠各40只，雌性，6-8周龄，体重18-20 g，SPF级，由吉林大学白求恩第一医院转化医学研究院动物实验中心提供。

1.2主要药物与试剂

环孢素A及雷公藤多甙均由吉林大学白求恩第一医院药剂科提供，Percpcy5.5标记的Anti-mouse CD4抗体和PE标记的Anti-mouse CD25抗体购于美国BD公司。

1.3实验分组

C57BL/6和BALB/C共80只小鼠按照随机数字表法分为4组，每组10对，BALB/C小鼠为供体，C57BL/6小鼠为受体，给予腹腔心脏移植手术处理。对照组：每日腹腔注射生理盐水；雷公藤多甙组：雷公藤多甙 25 μg/(g·d)腹腔注射；环孢素A组：环孢素A 2.5 μg/(g·d)腹腔注射；联合用药(环孢素A+雷公藤多甙)组：雷公藤多甙 25 μg/(g·d)+ 环孢素A 2.5 μg/(g·d)腹腔注射。

1.4小鼠腹腔心脏移植模型的建立

1.4.1麻醉方法2%戊巴比妥钠按5 μl/g腹腔注射，以小鼠意识、尾部和下肢痛觉消失为宜，麻醉效果不佳时可追加2-5 μl。

1.4.2供体准备BALB/C小鼠麻醉成功后取仰卧位，消毒腹部皮肤，沿正中线剪开皮肤及腹膜，暴露下腔静脉，灌注肝素生理盐水(100 U/ml)1 ml。迅速沿两侧腋前线剪开胸廓，用5-0丝线分别结扎上下腔静脉，离断肺动脉，沿主动脉向心脏内灌注5 ml预冷生理盐水，离断升主动脉。用5-0丝线从心脏后方集束结扎其余血管，离断结缔组织，将取下的供心置于4℃生理盐水中保存备用。

1.4.3受体准备 C57BL/6小鼠麻醉成功后取仰卧位，消毒腹部皮肤，沿正中线剪开皮肤及腹膜，拨开肠管充分暴露腹主动脉与下腔静脉，小心并尽可能去除其周围的结缔组织。

1.4.4供心移植 用5 mm微血管夹于双侧肾血管及髂血管水平以阻断血流，在腹主动脉与下腔静脉表面各剪开与供心主动脉和肺动脉直径相当的椭圆形小口。用12-0显微缝合线行供心主动脉与受体腹主动脉的端侧吻合，再行供心肺动脉与受体下腔静脉的端侧吻合，5-0丝线连续缝合关闭腹腔。

1.4.5术后监测 术后通过触摸小鼠腹部心脏搏动情况判断供心功能，搏动消失即为供心停跳，视为移植物排斥。

1.5标本收集

每组6只小鼠每日腹部触诊，观察移植心存活情况。移植后第5日，每组杀4只小鼠。收集外周血，部分使用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，4℃保存进行流式细胞学检测备用，同时收集移植心，浸泡于10%福尔马林中保存，组织学形态观察备用。

1.6苏木精伊红(H&E)染色

取下的供心进行常规脱水包埋，并进行石蜡切片、烘片。玻片加入二甲苯I 15 min ，二甲苯Ⅱ 5 min，梯度乙醇脱水各5 min 。自来水充分清洗后加入苏木素染色15 min，自来水清洗。加入盐酸乙醇分化10 s，自来水冲洗。加入返蓝液33 s，自来水冲洗。再加入伊红溶液染色2 min，自来水冲洗。最后逐级升浓度乙醇脱水，再加入二甲苯I、二甲苯II各5 min 。盖玻片下甘油封片，进行光镜观察。

1.7外周血CD4+ 及CD8+T细胞检测

小鼠下颌静脉取血，肝素(500 U/ml)50 μl抗凝，与PBS混合后缓慢加入淋巴细胞分离液，4℃，1 650 rpm/min 离心5 min，分离白膜层，加入2 ml PBS重悬，4℃，1 650 rpm/min离心5 min，弃上清，用流式洗液FACs Buffer重悬细胞，将细胞浓度调整为3*105/100 μl，加入Percpcy5.5标记的Anti-mouse CD4抗体和PE标记的Anti-mouse CD8稀释液各10 μl，混匀，4℃避光孵育30 min，加入2 ml FACs Buffer离心洗涤，弃上清，加入250 μl FACs Buffer，流式细胞仪上机检测CD4+ 及CD8+T细胞所占百分比。

1.8统计学分析

2结果

2.1雷公藤多甙联合环孢素A对异位移植心存活时间的影响

通过术后每日触摸小鼠腹部心脏搏动情况，对照组(n=10)异位移植心平均存活时间为9.10±0.99天，雷公藤多甙组(n=9)异位移植心平均存活时间为12.00±1.00天，环孢素A组(n=9)异位移植心平均存活时间为11.78±0.83天，雷公藤多甙联合环孢素A组(n=10)异位移植心平均存活时间为15.90±1.29天。联合用药组相比对照组及单独用药组，均显著延长异位移植心存活时间(P<0.05)，异位移植心生存曲线见图1。

图1　腹腔心脏移植生存曲线

2.2移植心组织学形态观察

收集各组小鼠术后第5日移植心，H&E染色后镜下观察：对照组心肌细胞明显水肿，结构被破坏，间质弥漫大量炎性细胞浸润。雷公藤多甙联合环孢素A组心肌细胞结构轻微改变，心肌横纹较清晰，间质内少量炎性细胞浸润。雷公藤多甙组和环孢素A组镜下情况介于上述两组之间(图略)。

2.3小鼠外周血CD4+及CD8+T细胞比例

术后第5天，雷公藤多甙联合环孢素A组CD4+及CD8+T细胞占总细胞百分比明显低于对照组及单独用药组百分比(P<0.05)。(见图2A、B)

A．CD4+占总细胞数比例　B.CD8+占总细胞数比例

3讨论

环孢素A属于钙调磷酸酶抑制剂，通过抑制钙调蛋白的活性，从而抑制T细胞的增殖活化，达到抑制免疫反应的效果[7-9]。雷公藤多甙是从雷公藤根部提取出来的有效成分，具有抗炎、活血化瘀、抗菌、免疫抑制等功效[3,4]。作为免疫抑制剂，其可能通过抑制T细胞增殖而发挥作用[10,11]。

本研究中对环孢素A及雷公藤多甙设立独立用药组以及联合用药组，从小鼠腹腔心脏移植手术后移植心生存曲线可以看出，三组用药组的移植心存活情况均明显长于对照组。虽然单独用药组生存时间之间并无差异，但联合用药组的生存时间显著高于单独用药组。从组织学形态也可看出，对照组炎性细胞浸润明显，心肌组织破坏严重；单独用药组情况好于对照组，但其之间差别并不明显；联合用药组最优，心肌细胞水肿较轻，间质内少量炎性细胞浸润。这说明了雷公藤多甙联合环孢素A的给药方案增强了免疫抑制性，延长了移植物的存活时间。

通过检测小鼠外周血T细胞比例发现，三组用药组CD4+T细胞比例较对照组均明显下降，其中联合用药组下降幅度最为显著。对于CD8+T细胞比例的检测发现，环孢素A组CD8+T细胞比例下降的确不明显，但雷公藤多甙组和联合用药组CD8+T细胞明显降低，其中联合用药组下降幅度最为显著。说明雷公藤多甙可以减少外周血中CD8+T细胞比例。雷公藤多甙联合环孢素A用药可以显著降低外周血中活化T细胞比例，减轻免疫排斥反应，降低移植物排斥几率。

虽然本研究观察到雷公藤多甙联合环孢素A可以抑制外周血中CD4+和CD8+T细胞，减轻T细胞介导免疫排斥反应，降低移植物排斥几率，但两种药物之间的明确机制以及起到协同作用时的最佳用量尚不明确，仍需进一步研究探讨。

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(收稿日期：2015-01-16)

文章编号：1007-4287(2015)12-2009-03

*通讯作者

基金项目：吉林省科技厅项目(20120934)；国家自然科学基金面上项目(81470975)；吉林省卫生厅项目(2014Z042，2013Z002)