补阳还五汤对脑出血大鼠脑内整合素α1β1和α1亚基表达的影响

杨阿莉，吴 季，崔寒尽，唐 涛，杨期东

脑出血具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点，是卒中的主要类型。该病占全部脑卒中的10%～20%［1］，而在一些东方国家，该比例更高达30%～50%［2，3］。在中国，随着人口的增长及经济的发展，脑出血对于患者的家庭和社会造成了沉重的负担。

血溢脉外形成血肿，对组织的直接破坏、占位效应和周围组织继发性缺血是脑出血神经功能缺损的主要原因，而气虚血瘀是脑出血后各种生理病理变化的重要机制之一，因而益气活血是中医治疗脑出血的重要治法。课题组既往研究证实脑出血后损伤区通过血管新生重建微血管系统［4］。整合素(Integrins)是细胞表面的一族跨膜糖蛋白，它通过介导细胞间、细胞-细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)间的黏附和信号传导从而调控细胞的生物学行为，在血管新生过程中发挥重要的作用［5］。本实验选用中医益气活血的代表方补阳还五汤干预，采用免疫组织化学和蛋白免疫印迹方法，以了解益气活血中药对脑出血后损伤区整合素α1β1和α1亚基表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 第一部分:Sprague-Dawley(SD)大鼠150 只，雌雄各半，7～9 周龄，体重220～250 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供［许可证号:SCXK(湘)2009-0004］，饲养于中南大学实验动物学部。将大鼠随机分为假手术组、模型组、益气组、活血组及益气活血(补阳还五汤)组，每组30 只，5 组分别于造模灌胃3、7、14、21、28 d 后随机抽取6 只大鼠处死。第二部分:SD 大鼠18 只，随机分为假手术组、模型组、益气活血组，于造模灌胃14 d 后处死，余同第一部分。

1.2 中药制备 所有生药均一次性购自中南大学湘雅医院中药房，按以下比例制备中药浸膏。益气活血组:补阳还五汤全方(黄芪、当归、赤芍、红花、川芎、地龙、桃仁按20∶3∶3∶3∶2∶3∶3 比例);益气组:补阳还五汤益气组分(黄芪);活血组:补阳还五汤活血组分(当归、赤芍、红花、川芎、地龙、桃仁按3∶3∶3∶2∶3∶3 比例)。浸膏分别配成0.44，0.225，0.215 g/ml 的溶液，4 ℃保存备用。

1.3 脑出血模型制备 采用腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，取俯卧位固定于鼠脑立体定位仪(StoelTing TL-2 美国)，根据大鼠脑立体定位图谱进行苍白球定位:前囟后1.4 mm，旁开3.2 mm，深5.6 mm，微量注射器垂直进针，注入100 μl取自股动脉的新鲜自体动脉血，假手术组大鼠仅注入100 μl 生理盐水［6］。

1.4 动物给药及处理 大鼠术后苏醒当日即予灌胃。益气活血组、益气组、活血组每日分别予补阳还五汤全方、补阳还五汤益气组分、补阳还五汤活血组分4.4，2.25，2.15 g/kg(按体表面积计算为临床体重70 kg 成人剂量的3 倍)灌胃，2 次/d，2 ml/次。模型组和假手术组灌服蒸馏水2 次/d，2 ml/次。第一部分:各组大鼠分别灌胃3，7，14，21，28 d后予10%水合氯醛麻醉，以4 ℃的多聚甲醛心脏灌注固定，取脑，浸入多聚甲醛继续固定4 h，蔗糖溶液脱水，低温切片机(Shandon Cryotome E 英国)行30 μm冠状切片，4 ℃PBS 中保存备用。第二部分:各组大鼠灌胃后14 d 予10%水合氯醛麻醉，4 ℃生理盐水心脏灌注，取脑并分离右侧脑组织，将以苍白球(血肿)为中心的基底节部分置于冻存管中，浸入液氮后，－80℃保存备用。

1.5 免疫组织化学 切片室温复温，3% H2O2孵化30 min 去除内源性过氧化酶，5%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃封闭60 min，滴加整合素α1β1单克隆抗体(美国Novus 公司)(1∶100)和整合素α1单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)(1∶200)，37 ℃孵育60 min，4 ℃过夜，滴加二抗(1∶200)和ABC 复合物(北京中杉)(1∶100)，37 ℃孵育各60 min，DAB(北京中杉)镜下控制显色。脱水透明中性树脂封片。以上步骤除封闭后不洗外，各步骤之间用PBS 洗5 min×3 次。用PBS 代替一抗作阴性对照。

1.6 蛋白免疫印迹 组织从－80 ℃冰箱中取出后，加入RIPA 裂解液匀浆数次后置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12000 g/min 离心30 min，取上清。BCA 法测定蛋白含量，配制8%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，4 ℃电转移，封闭后加一抗(美国Novus 公司，美国Santa Cruz 公司)(1∶400)4 ℃孵育过夜，予TBST 漂洗后，加二抗(北京中杉)(1∶5000)室温孵育1 h。TBST 漂洗后，置于BIO-RAD凝胶成像仪中加入ECL 发光液检测蛋白条带。

1.7 图像分析 免疫组织化学法:免疫组化反应阳性结果为血肿周边血管内皮棕染。采用Motic Image Advanced 3.2 图像分析软件，每只大鼠随机选择4 张片，在光镜下(×200)，每张切片随机选择3 个视野进行分析，测定其阳性面积(单位mm2)和平均光密度(optical density，OD)值，以二者乘积代表整合素α1β1和α1表达水平，计算其表达量。免疫蛋白印迹法:伯乐凝胶成像系统软件分析各蛋白条带光密度，每组光密度值应与相应内参β-actin 相比较取比值后再进行组间比较。

2 结果

2.1 各组大鼠脑出血后整合素α1β1和α1亚基在新生血管的时空表达 假手术组未见明显阳性表达。各组3 d 时可在血肿周边查见阳性血管;7 d时阳性血管靠近血肿，14～28 d 时阳性血管明显增多，同时部分血管深入血肿区(见图1)。

图1 模型组大鼠脑出血14 d 后整合素α1β1(A)和α1(B)亚基的表达(DAB 染色，×200)

2.2 脑出血后大鼠血肿周围新生血管整合素α1β1的表达 假手术组未见明显阳性表达。模型组和各处理组新生血管内皮整合素α1β1的表达趋势大致相近。3 d 时即查见各组血肿周边新生血管内皮表达α1β1，各组表达无明显差异。7 d 时各组表达均增高，与3 d 比较差异明显(P＜0.05)。14 d时各组阳性微血管表达较7 d 继续增高(P＜0.05)，达到高峰。21～28 d 时高峰表达持续，同14 d 无明显差别(P＞0.05)。7～28 d 时益气活血组表达高于同时点的其他三组(P＜0.05)(见图2A)。

2.3 脑出血后大鼠血肿周围新生血管内皮整合素α1的表达 假手术组未见明显阳性表达。模型组和各处理组新生血管内皮整合素α1亚基表达趋势大致相近。3 d 时即查见各组血肿周边新生血管内皮表达整合素α1亚基，各组表达无明显差异。7 d 各组表达均增高，与3 d 比较差异明显(P＜0.05)。14 d 时各组阳性微血管表达较7 d 继续增高(P＜0.05)，达到高峰。21～28 d 高峰表达持续，同14 d 无明显差别(P＞0.05)。7～28 d 时益气活血组、14～21 d 活血组表达均高于同时点模型组(P＜0.05)，且益气活血组在21、28 d 时高于同时点益气组(P＜0.05)(见图2B)。

2.4 脑出血后大鼠血肿周围整合素α1蛋白表达 脑出血后14 d α1亚基蛋白表达增强，与假手术组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。而补阳还五汤干预后，α1亚基蛋白表达水平高于脑出血模型组(P＜0.05)(见图3)。

图2 脑出血大鼠血肿周边血管整合素α1β1(A)和α1(B)的表达

图3 脑出血后14 d 大鼠血肿周边整合素α1亚基的表达

3 讨论

血管新生是脑卒中后损伤区脑组织功能恢复的重要过程，与患者的预后密切相关。在此过程中，除血管内皮细胞自身增殖外，新生血管与ECM 之间的相互作用也非常重要。ECM 作为细胞黏附的基质，在血管新生的过程中起到传导信号、调控血管内皮细胞(endoththelial cells，ECs)生物学行为的作用。整合素作为ECM 的主要受体，介导了新生血管和ECM 的基本相互作用［7］。

目前发现的整合素家族中，整合素α1亚基仅参与构成整合素α1β1，且本研究第一部分实验结果显示血肿周围新生血管整合素α1亚基表达趋势与整合素α1β1基本一致，且整合素是由α 亚基及β 亚基组成的异二聚体，在蛋白免疫印迹法处理过程中会分离，故两部分实验中整合素α1亚基的表达均可认作是对整合素α1β1的验证。

整合素α1β1的配体为层粘连蛋白(laminin，Ln)。除了Ln，整合素α1β1还可以与胶原IV 特异性粘附。在血管新生过程中，α 亚基表达早期以α4和α5为主，后期则转变为α1和α6，同时其配体亦由纤连蛋白(fibrinogen，Fn)转变为Ln。故整合素α1β1主要作用于血管新生中后期以维持新生血管的稳定和完整性。另有研究证实，整合素α1β1通过生长因子介导ERK 信号通路可保护ECs 免于凋亡并增强ECs 增殖［8，9］。在整合素α1亚基敲除的动物中有过量的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-7、MMP-9、MMP-12 表达［10］，可将循环型纤溶酶原降解为血管抑素，进而抑制血管新生［11，12］。

脑出血后14 d 血管新生达到高峰［13］，本研究也显示脑出血后14～28 d 整合素阳性血管增多。既往有研究显示脑出血后7 d TNF-α 仍可刺激整合素α1β1过表达，所以脑出血7 d 时整合素α1β1和α1亚基表达较3 d 有所增高，而整合素α1β1主要作用在血管新生的中后期维持血管完整性，故在14 d时表达达到高峰并持续到28 d。整合素α1β1除了与配体Ln 结合外还可与胶原IV 特异性粘附，本课题组其他相关实验也证实胶原在血管新生的初始、侵入阶段都有表达［14］。脑出血后整合素α1β1表达上调的上游因素可能有:(1)各种生长因子表达上调:整合素α1β1可通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-A/VEGFR-2 机制上调表达［15］，VEGF 可以激活并增加整合素α1β1表达从而促进血管新生［16］。脑出血后肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α 表达增加［17］，研究证实TNF-α 的增加与整合素α1β1表达增高有因果关系［18］。(2)炎症反应:整合素α1β1可在激活的记忆T 细胞作用下表达，并参与炎症应答［19］。

脑出血属中医“中风”“卒中”“薄厥”范畴，气虚血瘀是出血性卒中后病理生理变化的重要机制之一，补阳还五汤是清代医家王清任在《医林改错》中为益气活血法所创代表方，中医运用补阳还五汤在临床上治疗脑出血患者疗效确切，且临床实验中本法可有效缩小血肿及水肿面积［20～22］。本实验发现益气活血法中的活血组分和补阳还五汤全方组处理后整合素α1β1和α1亚基在多个时点表达较模型组均明显上调，且以益气活血组更明显，提示补阳还五汤全方中益气组分和活血组分二者协同作用是临床疗效的基石。蛋白免疫印迹检测结果也显示:脑出血后整合素α1亚基蛋白表达水平增加，而益气活血组α1亚基表达明显高于模型组，可见补阳还五汤的干预加强了整合素α1β1对脑出血后血管新生的调节作用，进而促进损伤脑组织功能恢复。中医药干预能在脑出血急性期改变血液流变学，减轻脑水肿和炎性反应，减少凝血酶、炎症因子的释放，减少细胞凋亡［23］，部分可刺激整合素α1β1表达的因子(如TNF-α 等)会在处理组干预后减少，但处理组整合素α1β1的表达仍继续增高，可能由于药物干预刺激VEGF 表达较模型组升高［24］，而VEGF 是整合素α1β1促血管生成的主要刺激因子。

综上所述，本研究提示补阳还五汤可通过调节脑出血后新生血管整合素α1β1和α1的表达，参与维持新生血管的稳定，促进损伤区微血管系统重建，实现其益气活血的作用，从而修复损伤组织。这可能是益气活血中药治疗脑出血的重要机制之一，也将为脑出血后的联合治疗提供新的思路。

［1］Ikram MA，Wieberdink RG，Koudstaal PJ.International epidemiology of intracerebral hemorrhage［J］.Curr Atheroscler Rep，2012，14(4):300-306.

［2］Dennis MS.Outcome after brain haemorrhage［J］.Cerebrovasc Dis，2003，16(Suppl):9-13.

［3］王文志.中国脑卒中流行病学特征和社区人群干预［J］.中国医学前沿杂志，2009，1(2):49-53.

［4］Tang T，Liu XJ，Zhang ZQ，et al.Cerebral angiogenesis after collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Brain Res，2007，1175:134-142.

［5］Hodivala-Dilke KM，Reynolds AR，Reynolds LE.Integrins in angiogenesis:multitalented molecules in a balancing act［J］.Cell Tissue Res，2003，314(1):131-144.

［6］Maclellan CL，Silasi G，Poon CC，et al.Intracerebral hemorrhage models in rat:comparing collagenase to blood infusion［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2008，28(3):516-525.

［7］Rhodes JM，Simons M.The extracellular matrix and blood vessel formation:not just a scaffold［J］.J Cell Mol Med，2007，11(2):176-205.

［8］Perruzzi CA，de Fougerolles AR，Koteliansky VE，et al.Functional overlap and cooperativity among alphav and beta1 integrin subfamilies during skin angiogenesis［J］.J Invest Dermatol，2003，120(6):1100-1109.

［9］Senger DR，Perruzzi CA，Streit M，et al.The alpha(1)beta(1)and alpha(2)beta(1)integrins provide critical support for vascular endo-thelial growth factor signaling，endothelial cell migration，and tumor angiogenesis［J］.Am J Pathol，2002，160(1):195-204.

［10］Steffgen K，Dufraux K，Hathaway H.Enhanced branching morphogenesis in mammary glands of mice lacking cell surface beta1，4-galactosyltransferase［J］.Dev Biol，2002，244(1):114-133.

［11］Patterson BC，Sang QA.Angiostatin-converting enzyme activities of human matrilysin(MMP-7)and gelatinase B/type IV collagenase(MMP-9)［J］.J Biol Chem，1997，272(46):28823-28825.

［12］Dong Z，Kumar R，Yang X，et al.Macrophage-derived metalloelastase is responsible for the generation of angiostatin in Lewis lung carcinoma［J］.Cell，1997，88(6):801-810.

［13］Zhou HJ，Zhang HN，Tang T，et al.Alteration of thrombospondin-1 and-2 in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage.Laboratory investigation［J］.J Neurosurg，2010，113(4):820-825.

［14］罗 娟，唐 涛，吴 季，等.益气活血法对脑出血大鼠脑组织Ⅳ型胶原表达的影响［J］.中国老年学杂志，2011，31(15):2882-2884.

［15］Ramjaun AR，Hodivala-Dilke K.The role of cell adhesion pathways in angiogenesis［J］.Int J Biochem Cell Biol，2009，41(3):521-530.

［16］Lee TH，Seng S，Li H，et al.Integrin regulation by vascular endothelial growth factor in human brain microvascular endothelial cells:role of alpha6beta1 integrin in angiogenesis［J］.J Biol Chem，2006，281(52):40450-40460.

［17］Wang J，Dore S.Inflammation after intracerebral hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(5):894-908.

［18］Ding YH，Li J，Yao WX，et al.Exercise preconditioning upregulates cerebral integrins and enhances cerebrovascular integrity in ischemic rats［J］.Acta Neuropathol，2006，112(1):74-84.

［19］Baker KA，Hagg T.Developmental and injury-induced expression of alpha1beta1 and alpha6beta1 integrins in the rat spinal cord［J］.Brain Res，2007，1130(1):54-66.

［20］孙振山.补阳还五汤加减治疗急性期中小量脑出血30 例［J］.长春中医药大学学报，2007，23(2):49-50.

［21］孙 皓，郭富强，王多姿，等.补阳还五汤化裁对大鼠脑出血后脑水肿的影响［J］.中国医药导报，2013，10(12):22-23.

［22］尹浩军，魏发善.补阳还五汤加减治疗高血压性脑出血的临床观察［J］.湖北中医杂志，2014，36(6):1-2.

［23］秦 峰，王长松，晋光荣，等.犀角地黄汤对大鼠脑出血急性期Bcl-2，caspase-3，TNF-α，IL-6 表达的影响［J］.中国中药杂志，2009，34(12):1566-1569.

［24］刘小娟，唐 涛，罗杰坤，等.补阳还五汤对脑出血大鼠脑内血管内皮生长因子mRNA 表达的影响［J］.中药新药与临床药理，2007，18(2):100-103.