脓毒症患者血中CD4+CD25+调节性T细胞水平与机体细胞免疫状态的相关性研究

耿延青

[摘要] 目的 探讨脓毒症患者CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的水平与细胞免疫的关系。 方法 以2013年7月～2014年6月浙江省温岭市第一人民医院收治的脓毒症患者53例为观察组。将观察组患者按病情分为脓毒症组（18例）、严重脓毒症组（21例）、脓毒症休克组（14例）；按28 d预后情况分为死亡组（16例）和存活组（37例）。另选取25名健康者为对照组。用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg及T细胞亚群水平并进行组间比较。 结果 CD4+CD25+Treg表达率：脓毒症休克组>严重脓毒症组>脓毒症组>对照组，各组间差异有统计学意义（P < 0.05）。CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平：脓毒症组>对照组>严重脓毒症组>脓毒症休克组，各组间差异有统计学意义（P < 0.05）。CD8+水平各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。死亡组CD4+CD25+Treg表达率明显高于存活组（P < 0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明显低于存活组（P < 0.05）；CD8+水平两组间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 脓毒症患者Treg细胞水平增高，可能导致T淋巴细胞亚群水平降低，在预测患者预后方面有一定作用。

[关键词] 脓毒症；细胞免疫；CD4+CD25+调节性T细胞

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（c）-0007-05

脓毒症（sepsis）是感染导致的炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。脓毒症造成多器官功能衰竭是严重创伤患者死亡的主因之一。已往研究认为，脓毒症是过度炎性反应的一系列综合征，也就是机体自身灭活病原体的免疫机制被过度激活，导致炎性反应失控，从而引起机体自身损伤，导致多器官功能衰竭甚至死亡。对脓毒症发病机制的深入探索揭示，除了病原菌及其毒素对正常组织的侵害之外，机体自身免疫功能失衡也在脓毒症的发病及进展中也起着重要作用[1]。免疫亢进与免疫抑制两种病理状态同时存在，加剧了脓毒症的进展。近年研究发现，机体中存在着CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）。脓毒症患者Treg水平升高，从而启动免疫抑制效应，诱发T淋巴细胞过度凋亡，这正是脓毒症患者免疫功能紊乱的发生机制[2]。本研究检测了脓毒症患者Treg细胞与T细胞亚群水平，分析两者的相关性及与脓毒症患者病情与预后的关系，现总结报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年7月～2014年6月在浙江省温岭市第一人民医院（以下简称“我院”）治疗的脓毒症患者53例为观察组。纳入标准：符合国际脓毒症定义会议制订的诊断标准。排除标准：①患有自身免疫系统疾病；②急性脑卒中；③心肌梗死；④病毒性肝炎；⑤HIV感染；⑥入院前3个月内使用过激素或免疫抑制剂者。入选患者男31例，女22例；年龄31～69岁，平均（58.52±13.46）岁。疾病构成：消化道穿孔破裂术后21例；胆囊坏死及重症胆管炎12例；肠梗阻术后9例；肺部感染11例。选取25名健康者为对照组，男15例，女10例；年龄32～65岁，平均（56.25±14.62）岁。将观察组患者按疾病严重程度分为脓毒症组（18例）、严重脓毒症组（21例）、脓毒症休克组（14例）；按28 d预后情况分为死亡组（16例）和存活组（37例）。

1.2 方法

1.2.1 一般监测指标 监测记录血乳酸水平、氧合指数；评估急性生理和慢性健康评分（APACHEⅡ评分）。血乳酸水平检测仪器为美国雅培I-Stat血液分析仪。抽取动脉血1 mL，应用电极法测定血乳酸值。氧合指数通过测定动脉氧分压后计算得出（氧合指数=动脉氧分压/吸入氧浓度）。APACHEⅡ评分包括急性生理评分、年龄评分、慢性健康评分三部分，总分0～71分。

1.2.2 试验指标 符合脓毒症诊断标准的患者于入选当天采肘静脉血10 mL，4 h内应用流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg及T细胞亚群水平。另25名例健康者作为对照组同期进行试验。

试剂与仪器：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD25单抗，藻红蛋白（PE）标记的CD4单抗，CD25同型阴性对照试剂，CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS试剂（美国Beckman-Coulter公司），细胞膜渗透性试剂盒（美国eBioscience公司）。流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司）。

CD4+CD25+Treg检测：将25 μL抗凝全血加入试管中，再添加5 μL CD25-FITC与5 μL CD4-PE，混匀并在室温环境下避光反应15 min，添加500 μL溶血剂，放置于37℃水浴箱中保存10 min，然后上流式细胞仪检测。T细胞亚群检测：取100 μL全血，采用全血流式细胞仪三色标记法（直接免疫荧光标记法），确定CD3+、CD4+、CD8+并计算CD4+/CD8+。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般临床资料比较

不同病情患者各指标比较：血乳酸水平、APACHEⅡ评分，脓毒症休克组>严重脓毒症组>脓毒症组（P < 0.05）；氧合指数，脓毒症组>严重脓毒症组>脓毒症休克组（P < 0.05）。见表1。

不同预后患者各指标比较：存活组血乳酸水平、APACHEⅡ评分低于死亡组（P < 0.05）；存活组氧合指数高于死亡组（P < 0.05）。见表2。

2.2 各组CD4+CD25+Treg表达率与T细胞亚群水平比较

不同病情患者各指标比较：CD4+CD25+Treg表达率，脓毒症休克组>严重脓毒症组>脓毒症组>对照组（P < 0.05）；CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平，脓毒症组>对照组>严重脓毒症组>脓毒症休克组（P < 0.05）；CD8+各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

不同预后患者各指标比较：死亡组CD4+CD25+Treg表达率明显高于存活组（P < 0.05）；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明显低于存活组（P < 0.05）；CD8+两组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

2.3 各指标相关性分析

脓毒症患者CD4+CD25+Treg表达率与APACHEⅡ评分呈正相关（r=0.793，P < 0.05）；与血乳酸水平呈正相关（r=0.627，P=0.01）；与CD4+/CD8+呈负相关（r=-0.623，P < 0.05）。

3 讨论

3.1 促炎/抗炎反应失衡促进脓毒症发病的机制

脓毒症的本质是机体对感染的过度免疫反应。目前认为促炎反应/抗炎反应动态失衡在脓毒症的发生发展中起重要作用。促炎/抗炎反应过程可分为两个阶段：

第一个阶段是炎症反应综合征期。此时期的显著特征是细胞免疫状态呈增高趋势，主要为大量产生TNF-α、IL-1β等前炎症细胞因子，使机体的炎性反应被充分激活，导致单核细胞急剧增殖，同时活性水平增高，分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等细胞因子，诱导抗原性T淋巴细胞活化。TNF-α、IL-1 和 IL-6也是脓毒症早期的促炎因子，可以通过促进自由基、缓激肽、组胺等产生，激活补体等，加重脓毒症患者的组织损伤[3]。另外，在脓毒症患者的促炎反应还表现为前列腺素E2（PGE2）和转化生长因子-β（TGF-β）合成增多，对机体的免疫功能产生了很大的影响[4]。

第二个阶段是代偿性抗炎反应期。激发炎症反应综合征之后，随着脓毒症促炎反应发展，在脓毒症的后期，机体启动代偿性抗炎反应，进入免疫抑制状态，严重者甚至出现免疫麻痹，其典型表现是CD4+ T淋巴细胞以及B淋巴细胞不断出现凋亡，而且增殖能力明显降低，其造成的免疫抑制是脓毒症病理生理机制的关键环节，使机体对病原体的易感性明显增加。同时，在机体的负向调控机制中，细胞因子也发挥了重要的作用。IL-10是由多种细胞（如单核细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞等）分泌的抗炎细胞因子，是机体重要的免疫调节因子，作为抗炎因子主要对单核/巨噬细胞发挥影响，抑制巨噬细胞的黏附、激活。随着IL-10等抗炎细胞因子水平升高以拮抗过度产生的前炎症细胞因子，而前炎症细胞因子水平明显降低，导致机体免疫功能低下，尤其是抗感染的功能严重受损，成为病情进一步恶化的主要原因。研究证实，IL-10水平升高被认为与脓毒症时免疫功能紊乱相关[5]。有报道显示，应用相应的抗原和IL-10反复刺激可以抑制细胞因子，诱导特异性调节性T淋巴细胞增殖、克隆，从而发挥免疫抑制作用。

3.2 Treg细胞对脓毒症免疫功能的影响

在动物和人类脓毒症患者中，均被证实发生了大量CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞凋亡。秦庆华[6]指出，大约1/2由于脓毒症致死的患者表现为淋巴细胞的凋亡增加，虽然未发现CD8+T淋巴细胞等的数量出现明显减少，但CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞浓度均显著降低。由于淋巴细胞的大量凋亡，使活化的T淋巴细胞不断被清除，这诱导了T淋巴细胞的克隆无反应性，导致其对抗原刺激失去反应，无法对抗病原体的侵袭，并且分泌细胞因子的能力也明显受到抑制。伴随着淋巴细胞大量凋亡的还有树突状细胞，后者是功能最强的抗原递呈细胞，其凋亡使细胞的抗原递呈能力明显受损，进而引起CD4+T淋巴激活功能障碍，进一步加剧了机体的免疫功能异常反应。

CD4+CD25+Treg是1995年Sakaguchi等在小鼠体内发现的，其在正常人和小鼠外周血CD4+T细胞中的含量占1%～2%，主要特征性表达CD25（IL-2受体的A链），具有分泌IL-10与PGE2的功能，是一类重要的免疫抑制细胞，广泛参与多种免疫调节机制。近年来较多研究表明，CD4+CD25+Treg在脓毒症复杂的免疫调节中发挥着对细胞免疫的抑制作用，可影响机体的天然免疫和获得性免疫。盛志勇等[7]认为，脓毒症患者机体的免疫反应倾向于Th2型，Th2型细胞因子生成增多而Th1型细胞因子产生减少，明显损害了机体的细胞免疫功能。Treg可以抑制CD4+/CD8+T淋巴细胞功能，介导Th1向Th2反应漂移，调节促炎、抗炎介质水平，下调树突状细胞表面共刺激分子的表达，影响免疫细胞如单核巨噬细胞、中性粒细胞的凋亡和增殖，特别是诱导T淋巴细胞的凋亡[8]。研究表明，Treg细胞水平与脓毒症的发病存在密切关系，脓毒症发病时Treg水平明显升高。在脓毒症患者中，CD4+CD25+Treg升高在死亡者中多见，提示CD4+CD25+Treg在某种程度上能够表现脓毒症患者病情的严重程度，能够为预测患者的预后提供依据[9]。Zhang等[10]从基因水平证实上述结论，其研究发现，脓毒症患者Treg细胞的特异性标志Foxp3 mRNA明显增多。Hein等[11]研究报道脓毒症患者Treg水平与ASPs Ⅱ及乳酸水平存在负相关。

本研究结果显示，CD4+CD25+Treg表达率：脓毒症休克组>严重脓毒症组>脓毒症组>对照组；脓毒症组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+明显高于对照组，严重脓毒症组和脓毒症休克组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+则显著下降。相关性分析表明：脓毒症患者CD4+CD25+Treg表达率与APACHEⅡ呈正相关，与乳酸水平呈正相关，与CD4+/CD8+呈负相关。T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+是机体的免疫功能状态的重要指标。Inoue等[12]研究发现，采用干预措施减少CD4+和CD8+的凋亡，能够改善脓毒症的生存率。这说明随病情加重，脓毒症患者Treg水平呈上升趋势，从而加剧免疫无反应状态。有关Treg诱导淋巴细胞凋亡的机制，可能有以下多种不同的途径：①IL-2是细胞增殖信号，在T淋巴细胞增殖过程中起着重要的激活作用。Treg细胞上的CD25能够与效应细胞竞争结合IL-2，使IL-2无法正常发挥增殖信号功能[13]。②Treg细胞能够诱导IL-10水平的升高，从而发挥免疫抑制效应。③Treg细胞能够激活FAS和FASL，通过Caspase级联反应，诱发T细胞彼此杀伤或直接凋亡。④Treg细胞经TCR介导的信号刺激活化后，能导致免疫亢进转向免疫抑制。随着脓毒症病情的加重，Treg数量增加，免疫抑制加剧，最终导致患者免疫麻痹，甚至死亡。已有研究表明，通过使用胸腺肽，诱导和促进T淋巴细胞的分泌与成熟，能够有效提高IL-2的活性及受体表达水平，从而对脓毒症的免疫抑制产生刺激作用，逆转其免疫抑制状态，尤其是对于轻中度的免疫抑制状态能够通过上述治疗取得良好效果，而重度免疫抑制者经过较长时间持续治疗也能够获益[14]。进一步证明免疫抑制的形成与改善是影响患者预后的重要因素。

综上所述，临床上对脓毒症患者检测Treg水平能够反映患者的细胞免疫状态，对患者的预后有一定预测作用。但由于目前相关的临床研究还较少，其确切的调控机制还有待进一步深入探讨。由于脓毒症患者的免疫失衡涉及各种细胞因子及炎症介质，而且与神经、内分泌因素的调节作用存在密切关系，因此，仅分析某几种细胞或细胞因子的相关性，不可能全面了解其根本的发病机制。随着对Treg细胞的免疫调节功能认识的日益深化，对脓毒症的临床干预的切入点将会越来越多，从而为防治脓毒症及其他感染性疾病提供可靠的新手段。

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（收稿日期：2014-09-30 本文编辑：程 铭）