卤鸡腿中大肠杆菌生长模型的研究

朱泓全，唐雪姣，王 杨，朱艳霞，周 红，杨艳彬，张 玫，姬 华

(石河子大学食品学院，新疆石河子 832000)

大肠杆菌(Escherichia coli)周生鞭毛和菌毛，是人和温血动物肠道重要的兼性厌氧寄居菌群，也是水源和食品粪便污染指示菌。大肠杆菌通常对人体无害，是人和温血动物肠道中的优势菌群，但在大肠杆菌属中还存在一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物具有致病性［1，2］。预测微生物学是一个将微生物学、数学和统计学结合在一起的研究领域，通过建立数学模型来预测微生物在一系列环境条件下的生长、死亡情况。这些环境条件包括pH 值、水分活度(aw)、温度、气体环境等［3］。大肠杆菌是良好的卫生指示菌，对即食食品中大肠杆菌生长模型的研究可以用于食品微生物风险评估，为控制有害大肠杆菌提供科学的数据。本研究以即食食品卤鸡腿为载体，测定不同温度条件下大肠杆菌在卤鸡腿中的增长动态，通过修正的Gompertz 方程拟合基于温度变化条件下大肠杆菌一级生长动力学模型，应用平方根模型描述了温度对大肠杆菌最大比生长速率和延滞时间的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大肠杆菌16Z，分离自猪血样品，石河子大学食品学院微生物实验室保存。卤鸡腿，购自石河子大学绿苑食堂(鸡腿出锅后立即无菌操作运至实验室接菌处理)。实验用LB 培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。

自动灭菌锅，上海弘芯电子科技有限公司;生化培养箱，SPX-250B-Z 型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;净化工作台SW-CJ 型，苏州安泰空气技术有限公司;干燥箱，JINGHONG-53L，上海志泰设备有限公司;低温冷藏箱，BCD-268E 上海领德仪器有限公司;电热培养箱，HPX-9272 MBE 型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 活化及制备菌液 大肠杆菌16Z 接种于5mL 的LB 培养基中，置于37℃培养18h，将该菌体用0.85%生理盐水配制成0.5 麦氏浊度菌液。用移液枪吸取1mL 0.5 麦氏浊度的大肠杆菌菌液于99mL 0.85%生理盐水锥形瓶中，充分振摇;用移液枪吸取1mL 锥形瓶中的大肠菌液置于另一份99mL 0.85%生理盐水中，充分振摇。此时所制得的菌液将作为大肠杆菌接菌液备用。

1.2.2 样品的制备 将卤鸡腿先用75%酒精棉球擦拭表面，然后无菌分割成约1.0 cm ×1.0 cm 的小块，去皮、去骨。将肉块置于无菌容器中，紫外翻转杀菌［4］。以保证卤鸡腿没有外源污染菌。

1.2.3 样品接菌及保藏 将鸡腿肉片放入大肠杆菌接菌液中，充分浸泡15 s，保证样品与菌液充分接触。将已接种大肠杆菌的鸡肉片放入无菌均质袋中，每袋25g样品。分别放入20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的条件下保藏。保存于40℃、35℃、30℃条件下的样品每隔2h 取出，进行菌落计数;保存于25℃下的样品每隔3h 取出，进行菌落计数;保存于20℃的样品每隔4h取出，进行菌落计数;每个样品做2 个平行试验，取平均数用于数据分析。菌落计数以菌落形成单位(colonyforming units，CFU)表示，按GB4789.2-2010 标准进行菌落计数［5］。

1.3 大肠杆菌生长曲线拟合

1.3.1 大肠杆菌一级生长模型 利用在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃条件下卤鸡腿中大肠杆菌增长动态数据，采用修正的Gompertz 方程拟合大肠杆菌一级生长模型，实验数据用Origin8.0 统计软件进行非线性回归。修正的Gompertz 方程如(1)式［6-9］:

(1)式中，Nt—t 时的微生物数量，log (cfu/g);N0—初始微生物数量，log (cfu/g);a、b、c—待定系数。

最大比生长率μm:μm=a·c/e;延滞时间λ:λ=(b－1)/c;最大菌数Nmax:Nmax=N0+a。

1.3.2 温度对大肠杆菌生长影响的二级生长模型Ratkowsky 等根据微生物在0—40℃温度条件下，生长速率或延滞时间倒数的平方根与温度之间存在的线性关系，提出平方根 (Belehradek)方程，方程式如(2)式［8-11］。

(2)式中，Tmin—假设的概念，指的是微生物没有代谢活动的温度;μm—最大比生长速率;λ—延滞时间;b—方程的常数。本实验数据利用CurveExpert 软件进行拟合。

1.3.3 大肠杆菌生长动力学模型的验证和可靠性评价应用拟合的大肠杆菌一级生长模型求得20℃、25℃、30℃、35℃和40℃时大肠杆菌菌数预测值，与试验中实际检测的大肠杆菌生长数值进行比较，采用偏差因子(Bias factor，Bf)和准确因子(Accuracy factor，Af)评价大肠杆菌一级生长动力学模型的可靠性如 (3)式［9，11］。

(3)式中，N实测—实验实际测得的大肠杆菌数量，log (cfu/g);N预测—应用微生物生长动力学模型得到的与N实测同一时间的大肠杆菌数量，log (cfu/g);n—实验次数。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌的一级动力学模型

利用修正的Gompertz 方程拟合在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃条件下大肠杆菌的生长数据，根据修正Gompertz 方程对大肠杆菌的生长曲线进行回归，拟合方程如表1。

表1 大肠杆菌一级生长模型和相关系数

相关指数R2可以评估回归方程对样本数据拟合效果的好坏。R2值越接近1，表明估计的回归方程对样本数据的拟合效果越好，R2值越接近于0 表明方程拟合效果越差［8］。由表1 可知，修正的Gompertz 模型适合拟合大肠杆菌在卤鸡腿中的生长状况;从拟合效果可知，相关指数R2都在0.933 6 以上，说明修正Gompertz 模型都能够充分地预测20—40℃温度范围内大肠杆菌在卤鸡腿中的生长规律。

表2 反应了在修正Gompertz 模型的基础上，计算出不同温度条件下大肠杆菌的最大比生长速率μm、延滞时间λ 以及最大细菌浓度Nmax。由表2 可知，随着贮藏温度的升高，生长速率总体呈上升趋势。延滞时间λ 随温度的升高而减小。当温度为35℃时，最大比生长速率μm最大，卤鸡腿中大肠杆菌最适生长温度为35℃。而当温度为20℃时，延滞时间λ 最长且比生长速率μm最小，因此适当降低贮存温度可有效防止大肠杆菌的生长繁殖。

表2 大肠杆菌的生长参数

2.2 温度对大肠杆菌生长动力学参数的影响

温度对微生物的生长动力学影响需要用二级方程平方根方程进行描述，见表3。

表3 大肠杆菌平方根二级方程及相关系数

根据Belehradek 方程拟合不同温度条件下最大比生长速率(μm)和延滞时间(λ)得出曲线做图。由图1、图2 可知，大肠杆菌最大比生长速率μm 随温度的上升逐渐增大，温度与最大比生长速率的平方根之间线性相关。延滞时间随温度的上升逐渐减小，温度与延滞时间倒数的平方根之间线性相关。从拟合曲线的相关系数可以看出，温度与生长速率的拟合度总体上优于温度与延滞时间的拟合度。

图1 温度与最大比生长速率μm的关系

图2 温度与延滞时间λ 的关系

2.3 大肠杆菌生长动力学模型的验证和评价

本研究采用偏差因子(Bf)和准确因子(Af)来评价已经建立的大肠杆菌的生长动力学模型。应用建立的修正Gompertz 模型求得20℃、25℃、30℃、35℃、40℃贮藏时的预测值，与试验中实际测得的大肠杆菌数值进行比较，由大肠杆菌的预测值和实测值来计算预测方程的偏差因子(Bf)和偏差因子(Af)，结果见表4。

表4 不同温度下大肠杆菌预测值的偏差因子和准确因子

偏差因子衡量预测值是否过高或过低估计了实测值，表示模型的结构偏差。准确因子衡量预测值与实测值的平均误差［8］。Ross［12］建议病原性细菌Bf的范围在0.9—1.05 为最好;0.70—0.90 或1.06—1.15 能够接受;Bf＜0.70 或者＞1.15 不能接受。Lebert［13］认为，Bf不能提供全面的模型准确性预测，Af显示预测值与观测值的接近程度，Af越接近1，模型越好。表4 说明建立的预测模型Af和Bf都接近于1，在可接受范围内。表4中偏差因子在1.000—1.025 之间，准确因子在1.017—1.069 范围内，表示误差比较低，说明建立的修正Gompertz 模型能够很好的预测大肠杆菌20℃—40℃下在卤鸡腿中的生长动态。

3 结论与讨论

本研究利用修正的Gompertz 方程建立了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下大肠杆菌在卤鸡腿中的生长曲线，结果表明，随着贮藏温度的升高，生长速率总体上里上升趋势。在20℃，大肠杆菌生长较缓慢，μm值较低，随着温度升高μm逐渐增大，延滞时间λ 随温度的升高而减小;在35℃条件下，鸡腿中大肠杆菌生长速率最高。本实验计算的偏差因子和准确因子接近1，修正Gompertz 模型能够较好地预测20—40℃贮藏温度下大肠杆菌在卤鸡腿中的生长动态。本文应用平方根方程(Belehradek 方程)建立了卤鸡腿中大肠杆菌随温度变化的动力学模型，包括最大比生长速率和延滞时间的预测模型，得出最大比生长速率随温度的上升逐渐增大，温度与最大比生长速率的平方根之间线性相关的结论。温度与生长速率的拟合度线性相关性较优于温度与延滞时间的拟合相关性。

姜英杰等［14］报道，大肠杆菌在7—16℃生猪肉中生长状态适合用修正的Gompertz 模型拟合，温度对最大比生长速率和迟滞时间的影响适合用Belehradek 方程拟合。唐艳等［15］报道，鲐鱼中大肠杆菌在8℃条件下用Gompertz 模型拟合度高，在12℃、16℃条件下用Logistic模型拟合度高，8—16℃条件下二级生长模型可以采用平方根模型进行拟合。张辉［4］研究发现，利用修正的Gompertz 模型能够很好地描述卤牛肉中食源性大肠杆菌在10℃、18℃、25℃、35℃贮藏条件下的生长动态，二级平方根模型拟合程度高。本研究结论与以上报道结论相近，对于4—20℃贮藏条件下卤鸡腿中大肠杆菌的生长曲线需要进一步研究。

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