二乙烯亚胺和甲醛对猫杯状病毒灭活效果比较研究

王一鸣，应瑛，陈小庆，李响，赵艳丽，胡桂学

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118)



二乙烯亚胺和甲醛对猫杯状病毒灭活效果比较研究

王一鸣，应瑛，陈小庆，李响，赵艳丽，胡桂学

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118)

为比较二乙烯亚胺(BEI)和甲醛对猫杯状病毒(FCV)的灭活条件，采用终浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%和0.3%的甲醛和终浓度分别为0.5%、1%、2%和3%的BEI在37 ℃对FCV灭活6、12、24、36、48 h，通过微量滴定法检测灭活病毒滴度变化，于F81细胞盲传3代验证病毒灭活效果，采用巢式PCR和ELISA法检测病毒抗原完整性。结果显示：37 ℃下作用48 h，1%、2%、3%的BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛均可灭活FCV。本研究结果可为FCV灭活疫苗的灭活工艺研究提供参考。

猫杯状病毒；二乙烯亚胺；甲醛；灭活

猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)是杯状病毒科 (Caliciviridae)疱疹病属成员，属于单股正链不分节段RNA病毒，可引起患病猫科动物鼻炎、结膜炎、急性口腔溃疡、肺炎和慢性胃炎等疾病[1]，世界各地均有分离该病毒的报道[2]。由于FCV进化引发的严重、急性、致死全身性疾病在世界范围内被频繁报道，对猫科动物的健康构成巨大威胁[3-4]。目前，对于FCV引起的呼吸道疾病尚缺乏有效的治疗手段，疫苗接种仍是预防该病的主要措施。

病毒的灭活是灭活疫苗开发的关键环节之一。甲醛是最常用的灭活剂，被广泛用于多种病毒灭活疫苗的制备。二乙烯亚胺(BEI)是另一类良好的病毒灭活剂，其作用原理是破坏微生物核酸，但不影响其蛋白质成分的结构，能最大限度地保留病毒抗原性[5]。2009年，Katsuo Masubuchi等[2]曾采用终浓度为0.2%的甲醛对FCV FC-7、FC-28 和 FC-64株进行灭活，并与ISA-70佐剂混合后免疫动物，收集的抗血清能够中和不同的FCV分离株。然而，至今尚未见应用BEI灭活FCV的报道。为此，本试验比较研究了不同浓度的甲醛和BEI对FCV的灭活效果，以期为FCV灭活疫苗开发的灭活工艺研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 MEM培养液、犊牛血清，购自HyClone公司；胰酶，购自GIBCO公司；BEI，购自北京依托华茂生物有限公司；0.1mol/L硫代硫酸钠溶液、甲醛(分析纯)，购自北京化工厂；Simply P总RNA提取试剂盒，购自Bioer Technology Co,Ltd；ReverTra Ace qPCR RT Kit，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；Cat FCV ELISA Kit，购自长春华益生物科技有限责任公司。

1.1.2 细胞及与病毒 F81细胞，本实验室保存；FCV-SH株，由军事兽医研究所惠赠，传至第6代。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度的测定 将病毒液用含2%犊牛血清的MEM细胞培养液连续进行10倍稀释(10-1～10-12)，向96孔板各孔依次加入100 μL稀释好的病毒液，重复4次，由后向前依次加F81细胞100 μL/孔。置37 ℃细胞培养箱，5 d后观察细胞病变情况并按Reed-Muench公式计算TCID50。

1.2.2 甲醛对FCV-SH株的灭活试验 向FCV-SH株病毒液(7.67 logTCID50/0.1 mL)中缓慢加入甲醛溶液，使甲醛终浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%和0.3%，充分振荡混匀，在37 ℃恒温摇床中120 r/min灭活6、12、24、36、48 h后分别取样微量滴定法检测灭活病毒滴度变化。

1.2.3 BEI对FCV-SH株的灭活试验 将1mmol/L BEI 溶液缓慢加入到病毒液(7.67logTCID50/0.1 mL)中，使BEI终浓度分别为0.5%、1%、2%和3%，充分振荡混匀，在37 ℃恒温摇床中120 r/min灭活6、12、24、36、48 h后分别用10% BEI体积的硫代硫酸钠溶液终止灭活，取样并用微量滴定法检测灭活病毒滴度变化。

1.2.4 病毒灭活验证试验 取0.5%、1%、2%、3% BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛灭活48 h后的病毒液分别接种已长成单层的F81细胞，400 μL/瓶，盲传3代，每次接毒后48 h观察细胞病变情况。

1.2.5 灭活病毒抗原完整性检测 根据文献[6]设计引物，并提取灭活前及灭活6、24、48 h后病毒的总RNA，反转录为cDNA后，用巢式PCR 法进行检测。PCR反应条件为：第一轮：95℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min。将第一轮PCR产物稀释50倍后作为第二轮模板。第二轮：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min。取PCR产物3 μL与6× loading buffer 混匀，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

按照Cat FCV ELISA KIT说明书对甲醛与BEI灭活后的FCV进行检测。

2 结果

2.1 不同浓度 BEI对FCV的灭活效果 37 ℃下不同浓度BEI灭活不同时间对FCV-SH株的灭活效果见图1。灭活后6 h，各浓度的BEI均使病毒滴度由107.67TCID50/0.1mL下降至102TCID50/0.1 mL以下，且BEI的浓度浓度越高，下降越明显。灭活后6～36 h，不同浓度BEI使病毒滴度下降均不明显，各浓度间差别较小。灭活后48 h，0.5%BEI未能完全灭活病毒，1%、2%和3%的BEI将病毒完全灭活，病毒滴度为0。

图1 37 ℃下BEI对FCV-SH株的灭活效果

2.2 不同浓度甲醛对FCV的灭活效果 37 ℃下不同浓度甲醛灭活不同时间对FCV-SH株的灭活效果见图2。灭活后6 h，各浓度的甲醛均使病毒滴度由107.67TCID50/0.1 mL下降至102TCID50/0.1 mL左右。灭活后24 h，仅0.2%甲醛使病毒滴度下降至102TCID50/0.1 mL以下，其他浓度组病毒滴度下降不明显。灭活后48 h，各浓度甲醛均使病毒完全灭活，但0.05%甲醛未使病毒滴度降至0。

图2 37 ℃下甲醛对FCV-SH株的灭活效果

2.3 灭活验证 除0.5%BEI灭活后接种F81细胞24 h左右引起病变外(图3)，其他浓度BEI和甲醛灭活48 h后接种F81细胞盲传3代均未观察到细胞病变，证明灭活彻底，无活病毒存在。

1. 0.5%BEI灭活后接种F81细胞24 h(10×10)；2. 正常F81细胞(10×25)

2.4 灭活病毒抗原完整性检测 经巢式PCR检测，两种灭活剂灭活前，病毒的ORF2片段能清楚地检测到，灭活后48 h，除0.5%的BEI在灭活后可见较暗的目的条带，1%、2%和3%的BEI均能将FCV完全灭活(图4)；各浓度的甲醛灭活48 h后，均检测不到目的条带(图5)。

1: 未灭活病毒;2: DL2000 Marker;3: 0.5%BEI灭活6h; 4: 0.5 %BEI灭活24h; 5: 0.5%BEI灭活48h;6: 1%BEI灭活6h;7: 1%BEI灭活24h;8: 1%BEI灭活48h; 9: 2%BEI灭活6h;10: 2%BEI灭活24h;11: 2%BEI灭活48h;12: 3%BEI灭活6h; 13: 3%BEI灭活24h;14: 3%BEI灭活48h;15: 阳性对照;16: 阴性对照

1: 未灭活病毒;2: DL2000 Marker;3: 0.05 %甲醛灭活24h; 4: 0.05 %甲醛灭活6h; 5: 0.05 %甲醛灭活48h;6: 0.1%甲醛灭活24h;7: 0.1%甲醛灭活6h;8: 0.1%甲醛灭活48h;9: 0.2%甲醛灭活24h;10: 0.2%甲醛灭活6h;11: 0.2%甲醛灭活48h;12: 0.3%甲醛灭活6h; 13: 0.3%甲醛灭活24h;14: 0.3%甲醛灭活48h;15: 阳性对照;16: 阴性对照

Cat FCV ELISA KIT对甲醛与BEI灭活后的FCV的检测结果见表1。根据试剂盒说明书中判定标准，各组OD值均有效。其中FCV灭活前样品的OD判为阳性，其余孔均判为阴性。

表1 FCV ELISA试剂盒检测各孔吸光度OD450结果

试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照孔平均值≤0.10；临界值= 阴性对照孔平均值+0.15；阴性判定：样品OD值<临界值；阳性判定：样品OD值≥临界值

3 讨论

FCV的衣壳蛋白是病毒致病性和抗原性的基础，其上存在众多B细胞抗原表位和中和表位，病毒的RNA具有感染性[7-9]。甲醛作为普遍使用的一种灭活剂，主要通过对蛋白和核酸的烷化作用，由烷基取代氨基、羧基、羟基、巯基或酚基上的氢原子，变成羟乙基，使病毒失活，丧失感染性。例如，甲醛可使病毒衣壳蛋白发生交联变性或使病毒颗粒聚集，然而这一作用可能会封闭病毒衣壳，阻止灭活剂作用于病毒核酸，使病原体逃逸灭活而产生疫苗致病风险，也降低了疫苗的免疫原性。此外，甲醛还存在刺激性、致癌危险、灭活不彻底、灭活时间长、灭活效果受多种因素影响等缺陷[10]。

BEI是一种烷化剂，由于其保存、毒性及成本等更为优越而被人们广泛采用。其灭活机制主要是通过烷化核酸分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤，引起单链断裂或双螺旋链交联，改变DNA的结构而破坏其功能，干扰RNA代谢合成，抑制细胞有丝分裂，也可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢，达到灭活目的。与甲醛相比，BEI能够破坏病毒核酸，使其丧失感染力，而不影响病毒抗原蛋白的空间构象和抗原决定部位的可接近性，从而保留其抗原性，是制备灭活病毒疫苗较好的灭活剂[5,10-12]。近年来，已有采用BEI灭活新城疫病毒[13]、猪细小病毒[11]、猪伪狂犬病毒[14]、猪肺炎支原体[15]、脊髓灰质炎病毒[12]和禽流感病毒[17]的报道，并通过动物免疫效力试验证明了BEI灭活在维持病毒免疫原性方面优于传统的甲醛灭活[11,13,15]。尽管如此，每种病毒对BEI 的抵抗力不尽相同，同时 BEI 对核酸具有较高的诱变作用，可能诱导产生突变型病毒株[10]，如果灭活不够彻底，将有毒株变异的风险。因此，探索BEI对不同病毒的灭活效果并寻找最佳灭活条件对灭活疫苗生产具有重要意义。

本试验尝试采用 BEI 对FCV-SH株进行灭活并与传统灭活剂甲醛进行效果比较，通过微量滴定法验证两种灭活剂的灭活效果。从试验结果可以看出，37 ℃下作用48 h，1%、2%、3%的BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛均可灭活FCV。BEI灭活组与甲醛灭活组相比，在灭活6 h时，条带较亮，而在24 h时条带较甲醛灭活组暗，说明BEI对病毒核酸的烷化作用比甲醛更强，能够更好地破坏病毒核酸，在灭活安全性上更具优势。同一灭活时间，0.1%的甲醛与0.2%的甲醛相比，对病毒的RNA显示出更好的破坏作用，表明高浓度的甲醛可能易于阻止其作用于病毒核酸。综上所述，BEI和甲醛均能灭活FCV，且BEI灭活效果优于甲醛。本试验仅比较了不同浓度的甲醛和BEI在不同时间对FCV的灭活效果，没有比较不同温度对灭活效果的影响，这有待进行后续试验。

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(编辑：李文平)

Comparision of Inactivation Effect of Binary Ethylenimine and Formaldehyde on Feline Calicivirus

WANG Yi-ming , YING Ying, CHEN Xiao-qing,LI Xiang, ZHAO Yan-li, HU Gui-xue*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

To study the best inactivated condition of Feline calicivirus (FCV)by binary ethylenimine(BEI) and formaldehyde,a strain of FCV was inactivated by BEI with final concentrations of 0.5%,1%,2%,3% and formaldehyde with 0.05%,0.1%,0.2%,0.3%, incubated at 37 ℃ for 6,12,24,36,48 h. The viral titers after inactivation were detected by microtitrimetry and inactivation effect validated by three blind passages on F81 cells.Novel nested PCR and ELISA method were used to detect the antigen integrity.The results showed that 1%, 2%, 3% BEI and 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%formaldehyde could inactivate FCV at 37 ℃ for 48 h.The results of this study can provide reference for research on inactivated technology of FCV inactivated vaccine.

Feline calicivirus; binary ethylenimine;formaldehyde;inactivation

公益性行业(农业)科研专项(201303042)

王一鸣，硕士研究生，从事动物病原学研究。

胡桂学。E-mail：huguixue901103@163.com

2015-08-04

A

1002-1280 (2015) 09-0015-05

S852.65