煎炸大豆油和云南牛干巴的品质变化与丙烯酰胺生成的关系及HPLC 测定方法的建立

曾 源，孙 灿，查保林，伍 欣

(1安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥 230000;2 云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201)

云南牛干巴是以黄牛后腿肉经腌制、晾晒、风干发酵而成的块状自然发酵肉制品，主产于滇东北的寻甸县、会泽县、鲁甸县等回民聚居区，因其悠久的历史(700 多年)、考究的工艺、独特的风味、酥脆的肉质、紫红的肉色、丰富的营养以及较长的保质期等深受各族人民、特别是回民的喜爱，年均上市超过100t［1］。油炸是牛干巴最普遍、最典型的烹饪方法。2002年4月，瑞典国家食品局和斯德哥尔摩大学的科学家联合公布了他们的研究结果:在油炸薯条、土豆片等淀粉类食物中，检测出有致癌可能性的丙烯酰胺［2］。报告一经发表，立即引起了世界各国食品行业的广泛关注，随后世界上许多国家纷纷对此问题展开了研究和讨论，结果一致认为大部分食品经过煎、烤、炸等高温烹调后会产生含量不等的丙烯酰胺，且其含量随加工温度的升高而增加［3］。

国际上普遍采用的丙烯酰胺检测方法为气相色谱-质谱检测法(GC-MS)和液相色谱-质谱检测(LC-MS)，这两种方法均采用质谱检测器，定性准确，但是仪器价格昂贵，且GC-MS 法尚需要衍生化处理，操作繁琐，不适于实验室推广［4］。而高效液相色谱法前处理简单、分离效能高、紫外检测器定量准确，采用标准物质保留时间或加外标验证完全可以对丙烯酰胺定性，因此对油炸肉类食品中丙烯酰胺的研究显得很有必要。本研究简化了丙烯酰胺的提取过程，建立了一种适合检测油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的快速、准确、高效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛干巴样品 购于云南省昆明市沃尔玛超市(牛干巴成熟1 个月)。

1.1.2 煎炸用油 香满园大豆油(5L/桶)，购于云南省昆明市沃尔玛超市。

1.1.3 试剂 丙烯酰胺标准品(C3H5NO)，购于上海阿拉丁试剂公司(纯度＞99.9%)。甲醇(色谱纯)，购于美国Sigma 公司;三氯乙酸、甲醇、石油醚、无水乙醚、无水硫酸钠、95%乙醉、氢氧化钾、氢氧化钠、酚酞、碘化钾、三氯甲烷、冰乙酸、硫代硫酸钠、EDTA、淀粉等试剂均为分析纯。CarrezⅠ试剂:称取15g K4［Fe(CN)6］·3H2O 溶于100mL 水中;CarrezⅡ试剂:称取30g ZnSO4·7H2O 溶于100mL 水中;2-硫代巴比妥酸(纯度＞98.5%)，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 主要仪器与设备 Agilent1210 高效液相色谱仪，美国;UNICO 7200 紫外可见分光光度计:美国，中兴牌101 电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂有限公司;TGL-16C 高速离心机，上海安亭科学仪器厂;DS-1 高速组织捣碎机，上海启前电子科技有限公司;HH-1 恒温油浴锅，常州澳华仪器有限公司;SHA-BA 恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司;METTLER TOLEDO-FE20 PH计，瑞士;DENVER INSTRUMENT TD-114 电子分析天平，美国丹佛仪器公司;CHROMA METER CR—400 色差仪，北京科美润达仪器设备有限公司;DRAGON LAB均质机，上海人和科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理方法 分别将含有0%、10%、20%、30%、40%的H2O2溶液60mL 加入到160℃含有1 000mL食用大豆油的恒温油浴锅中，再将约20g 的牛干巴片(1×2×1cm)置于其中反应3min，取出在室温下冷却10min，置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 煎炸油和牛干巴品质分析

(1)煎炸油品质分析

过氧化值的测定:参照GB/T5538—2005 动植物油脂过氧化值测定;酸价的测定:参照GB/T5009.37—2003 食用植物油卫生标准的分析方法;羰基价的测定:参照GB/T5009.37—2003 食用植物油卫生标准的分析方法。

(2)牛干巴品质分析

褐变度的测定:参照翁江来［5］方法进行。称取2g油炸牛干巴样品，倒入圆底烧瓶，加入20mL 水解液(蒸馏水、氢氧化钠、亚硫酸钠质量比为200∶10∶1)，放置在55℃水浴锅中水浴加热1.5h，使粉末溶解于水解液中;然后取出，加入盐酸溶液，调溶液pH4.8，充分振荡，使溶液中的蛋白质沉淀;采用分析滤纸过滤，测量滤液的pH 值及其在420nm 波长处的吸光度，通常用其吸光度的大小代表类黑色素的含量即美拉德反应褐变程度。

TBARS 值的测定:参照孙伟［6］方法进行。准确称取切碎绞匀的油炸牛干巴样品10g，置于250mL 具塞三角瓶中，加入50mL 三氯乙酸(7.5%)－EDTA (0.1%)混合液，于恒温振荡培养箱中振荡60min，然后用双层滤纸过滤两次。准确移取上述滤液5mL 于25mL 比色管内，加入5mL TBA (0.02mol/L)溶液，混匀，加塞，置于100℃水浴中保温40min。取出，冷却1h，然后移入离心管内3 000r/min 离心5min，上清液倾入试管内，加入5 mL 氯仿，摇匀，静置(时间大于1h)，分层，吸出上清液于波长532nm 处比色。

色差的测定:使用CHROMA METER CR—400 色差仪测定。

1.2.3 牛干巴中丙烯酰胺含量的检测方法

(1)油炸牛干巴样品的前处理

称取粉碎后的牛干巴样品5g，置于30mL 离心管，加5mL 甲醇，均质3min，取上清液3mL 离心10min，取上清液加卡瑞试剂1、2 各100μL，离心15min (10 000r/min)，取2.5mL 上清液［7］，(若除油，加7.5mL 正己烷，振荡2min，移去上层正己烷)，氮吹干，加0.5mL 蒸馏水振荡2min，然后过C18小柱(过柱前先经过1mL 甲醇和1mL 水活化小柱)，收集过滤后的样液，过自制活性炭固相萃取小柱(活性炭对丙烯酰胺有很强的吸附性)，再用2mL 甲醇洗脱，收集洗脱液过0.45 微孔滤膜，即可进样。

(2)色谱条件的确定

色谱柱为VP—ODS—C18 (150mm (4.6mm);流动相为甲醇:水=10:90;检测波长为198nm;流速为0.6mL/min;柱温为25℃;进样量为10μL。

(3)样品加标回收率

称取5g 油炸牛干巴样品于30mL 的塑料离心管中，加入5mL 甲醇，然后分别加入1μg/mL 的丙烯酰胺标准溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mL，经高速离心、固相萃取过膜后进样分析。

平行称取5 份质量均为5g 的油炸牛干巴样品，经甲醇提取、高速离心、固相萃取后，通过高效液相色谱仪进行分析，计算标准偏差，判断其精密度。

(4)方法的检出限

每个样品平行测定3 次，将丙烯酰胺标准溶液进行一系列稀释，测定丙烯酰胺的色谱峰高，其S/N 为2～3h 的进样量即为该法的最低检测限。

(5)数据统计方法

试验数据采用EXCEL2007 和SPSS19.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 煎炸油品质变化与油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的关系

煎炸油品质变化与油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的关系见表1。

表1 煎炸油品质变化与油炸牛干巴中丙烯酰胺含量的关系

2.2 煎炸油各品质参数与丙烯酰胺含量相关性分析

油炸牛干巴中丙烯酰胺含量与煎炸油的酸价相关性最大，与羰基价的相关性次之，而与过氧化值的相关性最小，说明了降解程度不同的大豆油对牛干巴丙烯酰胺生成量大小有较大影响。酸价反映的是煎炸大豆油中游离脂肪酸含量的多少，羰基价反映的是在高温下产生的总羰基类化合物含量的多少［8］。油脂降解产物如羰基类化合物、游离脂肪酸以及极性组分中的某些物质(如:醛类化合物)与体系中丙烯酰胺含量的多少应该有密切关系，有可能也为生成丙烯酰胺提供了必要的前提物质，所以煎炸油的品质与其牛干巴中的丙烯酰胺含量有密切的关系(表2)。

表2 丙烯酰胺含量与煎炸油各品质参数的相关性分析

2.3 牛干巴品质变化与其中丙烯酰胺含量的关系

牛干巴品质变化与其中丙烯酰胺含量的关系见表3。

表3 牛干巴品质变化与其中丙烯酰胺含量的关系

2.4 牛干巴各品质参数与丙烯酰胺含量的相关性分析

油炸牛干巴中丙烯酰胺含量与a*相关性最大(相关系数为0.952)，与褐变度的相关性次之(相关系数为0.941)，而与TBARS 值的相关性(相关系数为0.929)最小(表4)。a*反映了牛干巴的色泽，a*越大，牛干巴越显红色。褐变度反映的是牛干巴在美拉德反应的最后阶段生成的类黑精的含量。TBARS 值反映的是不饱和脂肪酸氧化产生的丙二醛的含量［9］。随着油脂氧化程度的加剧，类黑精含量不断增加，而产生丙二醛的氢过氧化物发生了一定程度的降解，所以牛干巴品质与丙烯酰胺含量之间有着密切的关系。

表4 丙烯酰胺含量与牛干巴各品质参数的相关性分析

2.5 丙烯酰胺标准曲线的绘制

分别取10μg/mL 的标准储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL 定容于100mL 容量瓶中，用高纯水分别稀释成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2μg/mL 的系列标准溶液，各进样10μL 进行HPLC 测定。以丙烯酰胺浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标建立线性回归方程(图1)。

图1 丙烯酰胺标准曲线

图1 显示，丙烯酰胺标准样品在质量浓度在0.01～0.2μg/mL 时，峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系，回归方程为y=4.228x+0.033，其相关系数R2=0.998。

2.6 丙烯酰胺标准样品的HPLC 色谱图

图2 显示，1μg/mL 丙烯酰胺标准样品的出峰时间为5.215min。

图2 丙烯酰胺标准样品的HPLC 色谱图

2.7 160℃油炸3min 牛干巴样品中丙烯酰胺的高效液相色谱图

图3 显示，样品中丙烯酰胺的色谱峰与杂质峰完全分离，基本不受干扰，说明样品前处理条件以及色谱测定条件具有良好的可行性。

2.8 样品中丙烯酰胺的加标回收率和精密度

样品中丙烯酰胺的加样回收率为96.61% ±2.48%，表明HPLC 检测油炸牛干巴中丙烯酰胺具有良好的准确性。相对标准偏差RSD 为1.556%，说明仪器精密度良好(表5)。

表5 样品中丙烯酰胺的加标回收率和精密度

2.9 检测限

以3 倍信噪比计算最低检出限，得到丙烯酰胺的最低检出限为14.7μg/kg。

3 结论

云南牛干巴中丙烯酰胺含量与煎炸大豆油的酸价相关性最大(相关系数为0.971)，与羰基价的相关性次之(相关系数为0.949)，与过氧化值的相关性最小(相关系数为0.928)。牛干巴中丙烯酰胺含量与牛干巴的a*相关性最大(相关系数为0.952)，与褐变度的相关性次之(相关系数为0.941)，而与TBARS 值的相关性最小(相关系数为0.929)。

前处理过程中，C18小柱结合活性炭小柱处理油炸牛干巴样品，能很好地保留丙烯酰胺，除去大部分共存物质，该方法的RSD 为1.556%、平均回收率为96.61%、检出限为14.7μg/kg。本研究建立的方法操作相对简单快速、精密度较高、回收率较好，具有一定的实用性。

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