正交试验法优选复方苦黄方的水提取工艺Δ

张 哲，李明春，石永坚，赵丽艳，程艳芹（解放军第401医院，山东青岛 266071）

复方苦黄方是解放军第401 医院治疗湿疹的纯中药外用方剂，由苦参、黄柏、蛇床子、防风、苍术等组成，具有祛风胜湿、清热燥湿、解毒止痒之功效。由其制成的洗剂在我院临床使用多年，疗效确切。但由于患者反映该制剂使用及运输保存均不方便，笔者对其进行了再次开发研究，拟将其开发成方便患者使用及保存的凝胶剂。为了最大限度地提取出有效成分，首先对其提取工艺进行优选。笔者在本试验中将方中蛇床子、防风、苍术等经超临界二氧化碳（SFE-CO2）萃取后的药渣与处方量的苦参、黄柏药材相混合，用正交试验设计法，以苦参中的苦参碱与氧化苦参碱含量之和、防风中的升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷含量之和、黄柏中的盐酸小檗碱含量以及浸膏得率为指标，综合评价，优选复方苦黄方的水提取工艺条件，以保证制剂的临床疗效。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；LC-10A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KH-100B 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；80-1型离心沉淀机（上海浦东物理光学仪器厂）；DV215CD 型电子分析天平（美国奥豪斯公司）。

1.2 药材

苦参（批号：070129），为豆科植物苦参Sophora flavescensAit.的干燥根；黄柏（批号：070801），为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮；防风（批号：0105200113），为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk的干燥根；蛇床子（批号：20110506），为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss 的干燥成熟果实；苍术（批号：001054508），为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea（Thunb.）DC.的干燥根茎。以上品种均购自同仁堂药业有限公司青岛分公司，由山东中医药大学张华副教授鉴定为真品。

1.3 药品与试剂

苦参碱对照品（批号：110805-200507，供含量测定用）、氧化苦参碱对照品（批号：110780-201007，纯度：92.3%）、升麻素苷对照品（批号：111522-201008，纯度：93.9%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号：111523-201007，纯度：96.5%）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-200910，纯度：97.9%）均购自中国食品药品检定研究院；液相色谱分析用甲醇、乙腈、无水乙醇均为色谱纯；液相色谱用水为高纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

参照复方苦黄方临床使用情况以及中药汤剂煎煮常规方法，为保证试验的可比性和可重复性，在饮片规格、提取次数、滤过、浓缩等条件相同的前提下，经过查阅文献[1]以及预试验，选择对提取结果影响明显的3 个因素即提取时间（A）、加水量（B）以及浸泡时间（C）为考察因素，采用L9（34）正交试验设计表安排正交试验。因素与水平见表1。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

2.2 样品液的制备

准确称量处方量苦参、黄柏药材，共9份，加入其他处方量按相同条件的SFE-CO2法萃取后的药渣，混合均匀后，依照表1及正交试验设计表进行试验。回流提取3次，滤过，合并3次提取液，浓缩定容至600 ml，制得1～9号样品液。

2.3 苦参碱和氧化苦参碱的含量测定[2-5]

2.3.1 色谱条件 色谱柱：依利特Hypersil APS-2（NH2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10），流速：1 ml/min；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.3.2 混合对照品溶液的制备 精密称取苦参碱对照品和氧化苦参碱对照品，分别加乙腈-无水乙醇（80∶20）混合溶液溶解、定容，制成质量浓度为1.976 mg/ml的苦参碱对照品贮备液和1.524 mg/ml的氧化苦参碱对照品贮备液。分别取2种对照品贮备液适量，置于同一量瓶中，用乙腈-无水乙醇（80∶20）混合溶液分别稀释定容成含苦参碱29.64、88.92、148.20、207.48、266.76、326.04 μg/ml 和含氧化苦参碱22.86、68.58、114.30、160.02、205.74、251.46 μg/ml的1～6号混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 分别精密量取“2.2”项下1～9 号样品液各20 ml，离心（3 000 r/min，离心半径5 cm）25 min；取上清液，用氨试液调pH至10，置于分液漏斗中，用三氯甲烷萃取5 次，每次20 ml；合并三氯甲烷液，置于60 ℃水浴上挥干；用适量无水乙醇溶解残渣，并转移至25 ml 量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，混匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得1～9号供试品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 称取除苦参外的其余处方量药材，照“2.2”和“2.3.3”项下方法，依法制得阴性对照溶液。

2.3.5 系统适用性试验 分别吸取阴性对照溶液、4号混合对照品溶液、1号供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定。结果显示，供试品色谱中，苦参碱保留时间为9 min 左右，氧化苦参碱保留时间为13 min 左右，均与对照品的保留时间一致；主成分峰与杂质峰分离度＞2.0，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 苦参碱和氧化苦参碱高效液相色谱图A.阴性对照溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.苦参碱；2.氧化苦参碱Fig 1 HPLC chromatograms of matrine and oxymatrineA.negative control solution；B.mixed reference substance solution；C.test sample solution；1.matrine；2.oxymatrine

2.3.6 线性关系考察 吸取“2.3.2”项下1～6号混合对照品溶液各20 μl，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样液质量浓度（x）为横坐标，以峰面积值（y）为纵坐标进行线性回归，得苦参碱回归方程为y＝512.0x+10.12（r＝0.999 9，n＝6），氧化苦参碱回归方程为y＝536.3x+1.070（r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，苦参碱和氧化苦参碱的检测质量浓度线性范围分别为29.64～326.04、22.86～251.46 μg/ml。

2.3.7 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验 按相关要求分别进行试验。结果，精密度试验中苦参碱和氧化苦参碱峰面积的RSD 分别为0.15%、0.22%（n＝6）；重复性试验中苦参碱和氧化苦参碱峰面积的RSD 分别为1.06%、1.73%（n＝6）；稳定性试验中样品液放置12 h 苦参碱和氧化苦参碱含量的RSD 分别为1.32%、1.10%（n＝6）；加样回收率试验中苦参碱和氧化苦参碱回收率分别为100.98%、98.61%，RSD分别为1.52%、1.25%（n＝6）。以上表明含量测定方法符合规定。

2.4 升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0 min，乙腈13%、水87%；20 min，乙腈30%、水70%）；流速：1 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.4.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥后的升麻素苷对照品和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加甲醇溶解，定容，制成质量浓度为471.2 μg/ml 的升麻素苷和519.6 μg/ml的5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液。分别精密移取以上2 种对照品溶液适量，用甲醇稀释定容，制成升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷质量浓度分别为7.5、15 μg/ml的混合对照品溶液。2.4.3 供试品溶液的制备 精密量取“2.2”项下1～9 号样品液各1 ml，通过中性氧化铝柱（100～200目，2 g，内径1 cm），用甲醇50 ml洗脱，收集甲醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml量瓶中，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得1～9号供试品溶液。

2.4.4 样品中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定 取“2.4.2”项下的混合对照品溶液及“2.4.3”项下的1～9号供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下，分别进样10 μl，记录峰面积，计算升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷含量之和。

经方法学考察，测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量的方法学符合要求，其具体内容另文发表[6]。

2.5 盐酸小檗碱的含量测定[7-10]

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（每1 000 ml水中加入0.05 mol磷酸二氢钾并用磷酸调pH 至2.5）（25∶75），流速：1 ml/min；检测波长：265 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.5.2 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷干燥后的盐酸小檗碱对照品，精密称定，加流动相溶解并定容，制成质量浓度为1.997 mg/ml的盐酸小檗碱对照品贮备液。移取对照品贮备液适量，再用流动相稀释定容，分别制成质量浓度为39.94、79.88、119.8、159.7、199.7 μg/ml的1～5号对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液制备 精密量取“2.2”项下的1～9 号样品溶液各2 ml，置于10 ml量瓶中，加入适量1%盐酸甲醇溶液超声10 min，放冷，用1%盐酸甲醇溶液定容至10 ml，离心（3 000 r/min，离心半径5 cm），取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得1～9号供试品溶液。

2.5.4 阴性对照溶液的制备 称取除黄柏外其余处方量药材，按照“2.2”项下1 号样品液处理方法和“2.5.3”项下供试品溶液制备方法，依法制得阴性对照溶液。

2.5.5 系统适用性试验 取阴性对照溶液、4号对照品溶液、1号供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.5.1”项下色谱条件测定。结果显示，供试品色谱中，盐酸小檗碱保留时间在10 min 左右，与对照品的保留时间一致；主成分峰与杂质峰分离度＞2.0，阴性对照无干扰。色谱图见图2。

2.5.6 线性关系考察 吸取“2.5.2”项下1～5号对照品溶液各10 μl，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样质量浓度（x）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得盐酸小檗碱回归方程为y＝23.23x－4.755（r＝0.999 9，n＝5）；结果表明，盐酸小檗碱检测质量浓度线性范围为39.94～199.7 μg/ml。

2.5.7 精密度、重复性、稳定性和加样回收率试验 按相关要求分别进行试验。结果，精密度试验中峰面积的RSD 为0.09%（n＝6）；重复性试验中峰面积的RSD 为1.72%（n＝6）；稳定性试验中样品溶液放置24 h 含量的RSD 为0.24%（n＝6）；加样回收率试验平均值为98.6%，RSD 为0.99%（n＝6）。以上表明含量测定方法符合规定。

2.6 浸膏得率的测定

精密吸取“2.2”项下1～9 号样品液各10 ml，按2010 年版《中国药典》（一部）“浸出物测定法”（附录ⅩA）项下方法[11]，置于已烘干至恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘3 h，计算浸膏得率[（浸膏量/10）×（总药液量/药材量）×100%]。

图2 盐酸小檗碱高效液相色谱图A.阴性对照溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；1.盐酸小檗碱Fig 2 HPLC chromatograms of berberine hydrochlorideA.negative control solution；B.reference substance solution；C.test sample solution；1.berberine hydrochloride

2.7 正交试验结果及方差分析[12]

取“2.2”项下1～9号样品液，分别测定提取液中苦参碱和氧化苦参碱含量之和（Y1）、升麻素苷含量和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量之和（Y2）、盐酸小檗碱的含量（Y3），同时计算浸膏得率（Y4）。根据4项指标对提取方法的影响程度，分别给予权重系数0.3、0.3、0.3、0.1。将所得数据标准化后进行综合评价{Y＝[（Y1/Y1max）×0.3+（Y2/Y2max）×0.3+（Y3/Y3max）×0.3+（Y4/Y4max）×0.1]×100}。正交试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验设计与结果Tab 2 Design and results of orthogonal test

方差分析结果表明，提取时间（A）对综合评价值具有显著性影响（P＜0.05）；极差分析结果表明，各因素对综合评价值影响的先后次序为提取时间（A）＞加水量（B）＞浸泡时间（C），各因素水平的强弱顺序为A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C1＞C3。结合操作实际和节约能源的需要，确定优选的工艺参数组合为A3B1C1，即提取时间120 min，加水量8、6、6 倍（以投料的药材和药渣总质量计），浸泡时间20 min。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

2.8 工艺验证

取处方量苦参、黄柏药材，共3份，分别加入其余处方量的按相同条件的SFE-CO2法萃取后的蛇床子、防风、苍术药渣，混合均匀后，加水浸泡20 min，回流提取3次，加水量分别为8、6、6 倍，每次提取120 min，按照“2.2”项下样品液的制备方法制备3 批样品，分别测定。结果，3 批样品苦参碱和氧化苦参碱的总含量平均值为3.152 6 mg/g，RSD为1.03%（n＝3），升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总含量平均值为4.977 2 mg/g，RSD为2.27%（n＝3）；盐酸小檗碱的平均含量为3.345 0 mg/g，RSD 为1.19%（n＝3）；浸膏得率平均值为49.23%，RSD 为2.43%（n＝3）。以上表明由正交试验筛选出来的水提取工艺稳定可行。

3 讨论

预试验曾考察药材吸水率、加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数对苦参碱与氧化苦参碱的总量、升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量、盐酸小檗碱的含量和浸膏得率的影响，最终选取对提取效果影响相对较大的3个因素：加水量、浸泡时间、提取时间为考察因素。验证试验结果表明，本正交试验所优选的水提取工艺稳定可行。

在苦参碱与氧化苦参碱的色谱分析中，曾使用甲醇、无水乙醇为供试液的溶剂，使用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-无水乙醇、乙腈-无水乙醇-3%磷酸为流动相。经过比较，结果以无水乙醇为供试品溶剂，2010 年版《中国药典》（一部）“苦参”含量测定项下[11]流动相条件中的乙腈-无水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10）为流动相时，样品峰形对称、与其他杂质峰分离度良好。

在盐酸小檗碱的含量测定中，曾参考2010 年版《中国药典》（一部）中“黄柏”含量测定项下的方法进行检测，但分离效果不好。笔者分析可能是由于本制剂属于复方制剂，其干扰成分与单味黄柏有很大差别所致。笔者在试验中发现，由于黄柏中既含盐酸小檗碱又含小檗碱，在用1%盐酸甲醇溶液定容时，先超声10 min，使小檗碱均转化成盐酸小檗碱，更便于含量测定。在选择测定波长时，取盐酸小檗碱对照品溶液在200～400 nm波长处扫描，显示盐酸小檗碱在265、346 nm波长处均有较大吸收峰，但在265 nm 波长处杂质峰干扰较少。因此，本试验选择265 nm为检测波长。在流动相的选择时，在水相为纯水的条件下，样品峰之间分离度不好，而且会出现严重的拖尾现象。当在水相中加入适量的磷酸二氢钾制备成0.05 mol/L的缓冲盐溶液并调节pH为2.5后，各峰之间的分离度均在1.5以上，达到了分离要求。

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