吉西他滨的体内外抗肝癌作用研究

孙家跃，左 靖，金义光（.宿州市立医院药剂科，安徽宿州 34000；.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药物化学研究室，北京 00850）

肝脏是人体内最大的器官，在消化、储存能量及生物转化解毒等方面扮演重要的角色。肝癌分为原发性肝癌和转移性肝癌。我国的肝癌多属于原发性肝癌，病死率高，在恶性肿瘤死亡中位居第3 位，仅次于胃癌、食管癌。原发性肝癌的治疗主要包括手术治疗、化疗、放疗及各种方式综合治疗等[1]，以手术切除疗法为主、同时运用各种手段进行综合治疗是目前肝癌治疗的主要方案[2-3]。但20世纪90年代至今，肝癌患者相对5年生存率一直在10%以下，主要是因为肝癌的高复发率和有效治疗药物的缺乏[4]，因此有效、相对安全的化疗药物的选择一直是研究热点。

吉西他滨是核苷类抗癌药，具有高缓解率、可延长生存期和低副反应等优势，能明显提高患者的生活质量，有效延长患者的生命，且在门诊使用符合药物经济学原则。临床上常应用于非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌症[5-7]，也有一些报道吉西他滨联合其他抗肿瘤药物治疗肝癌[8-9]。本文将进一步研究吉西他滨对肝癌细胞的体内外抑制作用，为吉西他滨对肝癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

BS110S 型电子天平（德国Sartorius 公司）；Heal Force®力康纯水仪（上海康雷分析仪器有限公司）；GL-88B型旋涡混合器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；TGL-16B 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

吉西他滨原料药（北京凯莱森医药科技有限公司，批号：20110203，纯度：99.6%）；DMEM培养基、二甲基亚砜（DMSO，分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；MTT 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3 细胞株

人乳腺癌MCF-7 细胞株购自北京化工大学细胞库；人肝癌HepG2 细胞株购自北京师范大学细胞库；小鼠肝癌H22 细胞株由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。

1.4 动物

SPF级昆明小鼠，♂，体质量25～30 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001。该动物实验通过军事医学科学院动物伦理委员会同意。

2 方法

2.1 吉西他滨对HepG2和MCF-7细胞的抑制作用

将HepG2 和MCF-7 细胞分别用DMEM 培养液稀释至1×104个/ml，接种于两块96 孔 板中，200 μl/孔。于5% CO2和37 Ⅵ饱和湿度培养箱中培养24 h 后，加不同浓度的吉西他滨使其终浓度分别为5、10、20、30、50、70、90 μmol/L。分别作用24、48、72 h后，除去培养液，每孔加20 μl MTT，4 h后加150 μl DMSO 溶解。于酶标仪450 nm 波长处测定各孔的光密度（OD），计算细胞抑制率，抑制率（%）＝[（不加药孔OD值－加药孔OD 值）/加药孔OD 值]×100%[10]。采用SPSS 软件Probit回归分析计算半数抑制浓度（IC50）。

2.2 吉西他滨对小鼠肝肿瘤的抑制作用

将H22细胞株复苏稀释后于无菌条件下接种在小鼠腹腔内增殖7 d，从瘤株生长较好的小鼠腹腔抽取H22细胞液，生理盐水稀释至2×1010个/L，取0.2 ml 皮下接种于小鼠右前腋下，10 d 后，手触有硬块即为瘤接种成功。挑取10 只荷瘤大小均匀的小鼠随机分为对照组（生理盐水）与吉西他滨组（40 mg/kg），每组5 只，每隔2 d 尾iv 药物1 次，共给药3 次[11]。观察小鼠毛发和精神状态，记录每天体质量变化。末次给药后第2天处死小鼠，摘取实体瘤，称瘤湿质量，计算吉西他滨的抑瘤率。抑瘤率（%）＝（对照组平均瘤湿质量－吉西他滨组平均瘤湿质量）/对照组平均瘤湿质量×100%。

2.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 16.0 统计软件进行One-way ANOVA分析，检验标准α＝0.05，比较各组间差异。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 吉西他滨对MCF-7和HepG2细胞的抑制作用

作用24 h 时，吉西他滨对MCF-7 的IC50为30 μmol/L，对HepG2 的IC50＞90 μmol/L；而作用48、72 h 时，吉西他滨对MCF-7 和HepG2 的IC50均＜5 μmol/L。吉西他滨作用24 h 时对MCF-7 细胞的抑制率均大于对HepG2 细胞的抑制率，差异有统计学意义（P＜0.05）。吉西他滨对MCF-7 细胞和HepG2细胞的抑制作用见图1。

图1 吉西他滨对MCF-7细胞和HepG2细胞的抑制作用A.24 h；B.48 h；C.72 hFig 1 Inhibitory effect of gemcitabine on MCF-7 cells and HepG2 cellsA.24 h；B.48 h；C.72 h

3.2 吉西他滨对荷瘤小鼠精神状态和体质量的影响

实验过程中，对照组荷瘤小鼠逐日消瘦，运动量减少，精神不振，毛发暗沉；而吉西他滨组荷瘤小鼠食欲正常，毛发有光泽，较活跃。对照组荷瘤小鼠瘤质量的增加消除了消瘦带来的体质量减少，导致其与吉西他滨组荷瘤小鼠的体质量差异无统计学意义，因此小鼠体质量对实验结果无影响。两组荷瘤小鼠的体质量测定结果见图2。

3.3 吉西他滨对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

对照组荷瘤小鼠的实体瘤湿质量分别为4.4、3.3、4.3、4.5、5.3 g，平均质量为（4.36±0.64）g；吉西他滨组荷瘤小鼠的实体瘤湿质量分别为1.9、0.9、0.9、1.1、0.8 g，平均质量为（1.12±0.41）g，吉西他滨对荷瘤小鼠的抑制率为75.76%。

图2 两组荷瘤小鼠的体质量测定结果Fig 2 Body weight of tumor-bearing mice in 2 groups

4 讨论

吉西他滨是一线抗肿瘤药物，对癌细胞有较强的杀灭作用。但目前其临床应用大多局限于对其特殊敏感的癌细胞，如乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等，在肝癌的治疗上却应用较少。本研究结果显示，≥30 μmol/L的吉西他滨体外作用72 h，对人肝癌细胞的抑制作用与其对人乳腺癌细胞的抑制作用相当；动物实验也初步表明，吉西他滨对小鼠H22实体瘤有较好的抑制作用。笔者认为临床上未将吉西他滨作为肝癌治疗首选药的主要原因可能是吉西他滨的肝组织分布不够高，在肝周围不易达到较高的治疗浓度，且较低的肝靶向性易引起较严重的副作用。笔者建议将吉西他滨与靶向材料相结合制成靶向肝组织的抗肝癌药物，应会有较广阔的临床应用前景。

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