胸腺五肽及其衍生肽的杀菌活性研究Δ

谢 婷，陶廷婷，梁宁生（广西医科大学附属肿瘤医院药学部，南宁 530021）

胸腺五肽（Thymopentin）是一种免疫调节药，临床上广泛用于免疫力低下等疾病的治疗。胸腺五肽是由胸腺生成素Ⅵ中的5 个氨基酸残基组成的肽链片段，位于多肽的第32～36位，拥有和胸腺生成素Ⅵ相同的全部生理功能。其主要作用之一是促进及诱导T细胞分化，提高生物体的免疫功能。当不同的淋巴细胞的量及功能发生改变时，机体就会产生免疫功能失调，使细菌等病原微生物容易侵入机体引起疾病[1]。胸腺五肽可通过免疫调节而发挥治疗作用，而其是否可以不通过免疫调节而直接杀菌，还从未有过报道。笔者尝试对胸腺五肽的分子结构进行研究。依据前期研究经验，胸腺五肽的分子结构具有抗菌肽的一些结构特点[2]，其氨基酸顺序为精氨酸（Arginine，R）-赖氨酸（Lysine，K）-天冬氨酸（Aspartic acid，D）-缬氨酸（Valine，V）-酪氨酸（Tyrosine，Y）（简称RKDVY）。笔者改变其氨基酸结构衍生出2 种衍生肽，希望通过研究RKDVY 及其衍生肽的杀菌活性，了解RKDVY 是否具有直接的杀菌作用，并初步了解杀菌作用与结构间的关系。

1 材料

1.1 仪器

Anke TGL-16C型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TU-1810S型紫光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 药品与试剂

人RKDVY（批号：130408916）、衍生肽1 RKN（天冬酰胺，N）VY（批号：130408915）、衍生肽2 RKKVY（批号：130408914），均由上海波泰生物有限公司合成和纯化，纯度均＞95%，每管4 mg；1%小牛血清白蛋白（BSA，批号：A8010）和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes，批号：710B043，纯度＞99%）由北京索莱宝科技有限公司提供；LB 营养琼脂（北京路桥技术责任有限公司，批号：120919）；LB培养基粉[生物工程（上海）有限公司，批号：13052119G]；无水CaCl2（成都科隆化工试剂厂，批号：20081106，纯度≥96%）；RPMI-1640 培养基（美国Thermo 公司，批号：NZD1128）。

1.3 细菌

革兰阴性（G－）菌：变形杆菌（ATCC 49027）和大肠埃希菌（ATCC 44113）；革兰阳性（G+）菌：粪肠球菌（ATCC 32088）和金黄色葡萄球菌（ATCC 26003）。以上标准株均由广西医科大学微生物学教研室提供，购自中国食品药品检定研究院。

2 方法

2.1 溶液的制备

以氨基酸序列为模板，设计合成了RKDVY、衍生肽1 RKNVY 和衍生肽2 RKKVY，将其溶解于400 µl 灭菌蒸馏水中，制备成质量浓度为10 g/L 的溶液，分装，－20 Ⅵ冷冻保存。每次根据试验需要取出使用，尽量避免反复冻融。3种五肽的一级结构和特性见表1。

表1 3种五肽的一级结构和特性Tab 1 The primary structure and characteristics of three pentapeptides

由表1 可知，3 种五肽都是阳离子肽，RKDVY 带有1 个正电荷，RKNVY带有2个正电荷，RKKVY带有3个正电荷；RKKVY碱性最强。三者间的不同都发生在第3位的氨基酸上。

2.2 杀菌活性的测定

采用琼脂铺板计数法[3]。取过夜培养的细菌，按1∶50 比例加入3 ml新鲜LB培养液，于37 Ⅵ恒温孵育2.5 h（对数生长期）；离心收集细菌，并将其沉淀物溶解于0.5 ml灭菌生理盐水中，继以分光光度计于660 nm波长处测定吸光度，记录吸光度达到0.1 时所需的细菌浓度，计算细菌稀释倍数。制备RPMI 1640 反应体系，含10 mmol/L Hepes、1 mmol/L CaCl2和1%BSA，pH 为7.4。依次将10µl 细菌（终浓度为1×107CFU/L）和10 µl 五肽或生理盐水（对照）加入到80 µl 的反应体系中，混匀，置于恒温水浴；2 h 后从该体系中取出反应液40 µl，加入360µl 灭菌生理盐水，连续10 倍稀释（1 000、250、62.5、15.625µg/ml），共3 次，从每一稀释倍数的稀释液中取出100µl 于无菌培养皿（直径为55 mm）中，再加入6 ml约55 Ⅵ灭菌LB营养琼脂，混匀，凝固，于电热恒温培养箱培养；18～24 h后，计算细菌菌落形成单位（CFU），以对照的CFU在30～300时为可用数据。计算五肽作用后的杀菌率，绘制杀菌曲线，并与对照比较。试验重复5 次，计算平均值。杀菌率＝（对照CFU－五肽CFU）/对照CFU×100%。

2.3 统计学方法

用SPSS 16.0统计软件，采用t检验方法。计量资料以表示，以α＝0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对G－菌的杀菌活性

3种五肽对G－菌的杀菌活性见表2。

表2 3种五肽对G－菌的杀菌活性（，n＝5，%）Tab 2 Bactericidal activity of three pentapeptides to G－bacterial（，n＝5，%）

表2 3种五肽对G－菌的杀菌活性（，n＝5，%）Tab 2 Bactericidal activity of three pentapeptides to G－bacterial（，n＝5，%）

注：与RKDVY比较，＊P＜0.01；与RKNVY比较，#P＜0.01Note：vs.RKDVY，＊P＜0.01；vs.RKNVY，#P＜0.01

由表2 可知，当五肽质量浓度为1 000µg/ml 时，RKDVY对变形杆菌和大肠埃希菌的杀菌活性在50%～60%，而RKNVY 和RKKVY 的杀菌活性在80%左右，均大于RKDVY。与RKDVY 比较，62.5、250、1 000 µg/ml 的RKNVY 和250、1 000 µg/ml 的RKKVY 的杀菌活性增加；与RKNVY 比较，62.5µg/ml的RKKVY的杀菌活性增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。3种五肽对G－菌变形杆菌和大肠埃希菌的杀菌活性的强度依次为RKKVY≈RKNVY＞RKDVY。

3.2 对G+菌的杀菌活性

3种五肽对G+菌的杀菌活性见表3。

表3 3种五肽对G+菌的杀菌活性（，n＝5，%）Tab 3 Bactericidal activity of three pentapeptides to G+bacteria（l，n＝5，%）

表3 3种五肽对G+菌的杀菌活性（，n＝5，%）Tab 3 Bactericidal activity of three pentapeptides to G+bacteria（l，n＝5，%）

注：与RKDVY比较，＊P＜0.01；与RKNVY比较，#P＜0.01Note：vs.RKDVY，＊P＜0.01；vs.RKNVY，#P＜0.01

由表3 可知，当五肽质量浓度为1 000µg/ml 时，RKDVY对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的杀菌活性在40%左右，而RKNVY的杀菌活性在70%左右，RKKVY的杀菌活性在90%左右。与RKDVY 比较，62.5、250、1 000 µg/ml 的RKNVY 和RKKVY 的杀菌活性增加；与RKNVY 比较，250、1 000 µg/ml的RKKVY的杀菌活性增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。3种五肽对G+菌金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的杀菌活性的强度依次为RKKVY＞RKNVY＞RKDVY。

4 讨论

4.1 胸腺五肽及其衍生肽的设计依据

目前已知的具有杀菌活性的抗菌肽分子都带正电荷[3]。笔者先前对抗菌蛋白——磷脂酶A2衍生肽的研究中也发现，含有相对较多的碱性氨基酸、带正电荷的衍生肽，杀菌强度往往较强[2，4-5]。胸腺五肽也带有1个净正电荷量，是碱性较强的肽分子，很有可能具有杀菌活性。因此，笔者根据胸腺五肽的结构，设计和合成了分子肽分子RKDVY、RKNVY 和RKKVY，检测其杀菌活性，并了解杀菌活性与结构间的关系。

4.2 胸腺五肽的杀菌作用

以往认为，胸腺五肽是通过调节机体免疫功能发挥作用，是免疫调节药。本研究结果表明，胸腺五肽对于几种临床常见的G－和G+菌具有杀灭作用，具有量效关系，以往未有相关报道。胸腺五肽同时兼具免疫调节活性和杀菌活性两种重要功能，很可能具有重要的临床应用意义，如第三代头孢菌素类抗菌药——头孢地嗪[6]，兼具广谱抗菌和免疫调节活性双重作用，特别适合用于免疫能力低又有细菌感染的患者。

4.3 胸腺五肽及其衍生肽杀菌活性与结构的关系

在结构上，RKNVY 是将胸腺五肽RKDVY 第3位的酸性氨基酸D替换成中性氨基酸N，衍生肽的酸性减弱，碱性增加，所带的净正电荷由1变为2。而衍生肽RKKVY则在同样位置将酸性氨基酸D 替换成碱性氨基酸K，碱性进一步增加，所带的净正电荷为3，也是3种肽分子中碱性最强的分子。对G+菌，碱性最强的RKKVY杀菌活性最强，而碱性居中的RKNVY次之，碱性最弱的RKDVY 最弱。而针对G－菌时，增加了碱性RKNVY和RKKVY都比RKDVY强，但在RKNVY和RKKVY间没有明显的差别，提示适当增加肽分子的碱性能增强杀菌活性，但进一步增加则活性没有明显的增强。这可能与G－菌和G+菌之间结构的差异，特别是细菌外膜结构的差异有关。

胸腺五肽作为免疫调节剂在临床已使用多年，其可以通过提高免疫力用于细菌感染性疾病[7]。本研究结果表明，其还具有直接杀菌作用。是否可以将胸腺五肽开发成为具有免疫调节作用和抗菌作用双重功能的药物，就像头孢地嗪一样，值得进一步研究。

[1]邹自英，朱冰，吴丽娟，等.不同种属细菌感染患者机体免疫功能变化的实验研究[J].实验与检验医学，2011，29（6）：605.

[2]何睿林，梁宁生.人ⅡA型磷脂酶A2衍生肽P26抗菌作用与结构修饰的研究[J].中国药理学通报，2011，27（9）：1 300.

[3]Dawgul M，Maciejewska M，Jaskiewicz M，et al.Antimicrobial peptides as potential tool to fight bacterial biofilm[J].Acta Pol Pharm，2014，71（1）：39.

[4]陶廷婷，史晓雄，梁宁生.人Ⅰ型磷脂酶A2的N末端衍生多肽PLA2N1-15的杀菌活性研究[J].中国药房，2014，25（29）：2 709.

[5]淳于柳爽，梁宁生.人ⅡA 型磷脂酶A2衍生多肽M17 杀菌作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（20）：216.

[6]龚正华.头孢地嗪对AECOPD患者临床疗效及细胞免疫功能的影响[J].山东医药，2013，53（37）：73.

[7]杨永明，曹云.胸腺五肽在治疗老年晚期恶性肿瘤伴发肺部感染中的作用[J].中国药物与临床，2013，13（3）：379.