黄芩素靶向p38 MAPK通路抗肺纤维化的作用机制研究

顾文菊邱波（湖北省黄石市第五医院普内科黄石435005）

黄芩素靶向p38 MAPK通路抗肺纤维化的作用机制研究

顾文菊邱波
（湖北省黄石市第五医院普内科黄石435005）

摘要：目的：探讨黄芩素（baicalein）抗肺纤维化（PF）的疗效，并通过测定p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活化程度，探讨其可能的作用机制。方法：6周龄健康SD雄性大鼠96只，随机分为正常对照组（C组）、肺纤维化模型组（M组）、p38 MAPK抑制剂SB 203580组（S组）和黄芩素组（B组），每组24只。造模或治疗后利用ELISA法检测血浆中促炎细胞因子高迁移率族蛋白B1 （HMGB1）及细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1（CINC-1）的水平；比色法测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性；Real-time PCR法观察结肠组织p38及p-p38基因表达水平。结果：M组大鼠血浆HMGB1、CINC-1均明显升高（P＜0.01），肺组织MPO活性升高（P＜0.01），p38磷酸化程度显著升高（P＜0.05）；与M组比较，S组和B组大鼠血浆HMGB1、CINC-1均明显降低（P＜0.01），肺组织MPO活性下降（P＜0.01），p38磷酸化程度显著下调（P＜0.05）。结论：黄芩素减轻博来霉素（BLM）诱导的大鼠肺纤维化，其作用机制可能与抑制p38 MAPK信号通路有关。

关键词：肺纤维化；黄芩素；靶向p38 MAPK通路；作用机制

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一种病因不明的慢性肺部疾病，属于肺间质纤维化的一种[1]，主要表现为纤维结缔组织在肺泡间隔弥漫增生引起肺组织结构毁损、顺应性减低、弥散功能障碍，最终导致呼吸衰竭[2~3]。肺纤维化的发病机理不明，也缺乏有效治疗，因此研究肺纤维化的发生、发展规律以及探讨新的有效防治手段是目前基础和临床关注的热点。本文对黄芩素（baicalein）治疗PF做了初步探讨，现报道如下：

1　材料和方法

1.1动物及分组6周龄健康SD雄性大鼠96只，购自河南大学实验动物中心，所有操作程序获得河

南大学医学伦理委员会批准。实验前禁食不禁水12 h，随机分为正常对照组（C组）、肺纤维化模型组（M组）、p38 MAPK抑制剂SB 203580组（S组）和黄芩素组（B组），每组24例。

1.2模型制备及处理参照李玉花等[4]的方法，M组以BLM制备PF模型，即大鼠乙醚吸入麻醉，操作台仰卧位固定，颈部消毒，切开颈部皮肤，逐层剥离，暴露气管，用一次性1 ml注射器抽取0.2~0.3 ml博莱霉素生理盐水溶液（5 mg/kg体重），向气管内注入，注射后立即将大鼠直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布，缝合皮肤，手术过程严格无菌操作。C组给予等体积生理盐水，S组和B组模型分别在BLM造模后第1天开始前连续腹腔注射SB 203580、黄芩素。

1.3方法

1.3.1 ELISA法检测血浆HMGB1、CINC-1水平采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）进行血浆促炎细胞因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）及细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1（CINC-1）水平测定，严格按照说明书操作。

1.3.2比色法测定肺组织MPO活性准确称量各待检大鼠肺组织，用0.9%生理盐水按1∶9制成10%匀浆，匀浆液直接分为两部分：一部分根据Bradford's方法，用蛋白定量分析试剂盒测上清液中蛋白浓度；另一部分用市售MPO检测试剂盒，按照说明书操作对肺脏组织中MPO活性进行检测。

1.3.3 Real-time PCR法检测p38、p-p38 MAPK mRNA表达留取部分肺组织立即投入液氮。从组织中提取总RNA：将整个胃组织剪碎，放入2 ml试管内，用Trizle法提取RNA；用分光光度法测定所提取RNA的浓度；RNA电泳检测其完整性（1%琼脂糖凝胶）；mRNA反转录：严格按照反转录试剂盒操作；PCR检测：采用primer premier 5.0设计p38、p-p38 MAPK及GAPDH基因引物序列，将每个cDNA样品2 L进行实时荧光定量PCR扩增，每个标本做复孔检测。用FTC 3000系统软件进行数据采集、分析。根据标准曲线计算各样本mRNA拷贝数，p38、p-p38 MAPK mRNA的相对表达量分别用p38、p-p38 MAPK mRNA拷贝数与GAPDH mRNA拷贝数的比值表示。

1.4统计学处理所有数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血浆HMGB1、CINC-1水平改变M组的HMGB1和CINC-1水平与C组比较明显升高，差异均具有显著意义（P＜0.01），S组和B组HMGB1、CINC-1水平均比M组明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1　血浆HMGB1、CINC-1水平改变（%，x±s）

2.2肺组织MPO活性变化与C组比较，M组大鼠MPO活性明显升高，而SB 203580和黄芩素处理可明显降低M组大鼠肺组织MPO活性。见表2。

表2　肺组织MPO活性改变

2.3p38、p-p38 mRNA表达的改变p38和p-p38基因表达情况，M组p-p38/p38比值较对照组明显升高（P＜0.05），而SB 203580和黄芩素处理组较M组显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3　p38、p-p38 mRNA表达的改变（%，x±s）

3　讨论

PF加重期病情进展快，发生呼吸衰竭和死亡的风险明显升高，目前尚无特效疗法。慢性炎症是纤维化的早期阶段，因此控制炎症可有效阻断纤维化进程。随着全世界对天然药物的开发越来越重视，从天然产物中寻找安全、有效、低毒的活性成分已经成为抗肺纤维化药物研发的新方向。黄芩是一味具有抑炎、抗菌、抗病毒、抗氧化作用的中药，黄芩素和黄芩苷是其主要组成及活性成分，其中以黄芩苷的含量最高，其次是黄芩素，而黄芩苷通过在体内代谢转化成黄芩素发挥作用。研究[5]发现，黄芩总黄酮对博莱霉素致大鼠肺纤维化具有明显的干预作用，为了进一步探索黄芩素的抗纤维化作用。本研究观察了黄芩素对博莱霉素致大鼠肺纤维化的治疗作用，发现黄芩素明显降低大鼠血浆HMGB1、CINC-1水平、肺组织MPO活性变化。

多条信号通路参与了对炎症反应的调节，其中p38 MAPK信号通路发挥了非常重要的调控作用。P38 MAPK信号通路激活后，促使下游IL-1、IL-6、TNF-琢等炎症介质基因表达上调、炎症因子释放，导致炎症反应[6]；同时促进细胞间黏附分子、趋化分子的表达上调[7]。本研究发现，M组大鼠肺组织p38磷酸化程度明显升高，说明肺纤维化时p38 MAPK被激活，应用其特异性抑制剂明显抑制p38激活，并降低大鼠血浆HMGB1、CINC-1水平、肺组织MPO活性；黄芩素在降低大鼠血浆HMGB1、CINC-1水平、肺组织MPO活性的同时抑制p38 MAPK激活。综上所述，黄芩素对肺纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与阻断p38MAPK通路有关

。

参考文献

[1]Katzenstein AL,Myers JL.Idiopathic pulmonary fibrosis:clinical relevance of pathologic classification[J].Am J Respir Crit Care Med, 1998,157(4 Pt 1):1301-1315

[2]Prasse A,Holle JU,Muller-Quernheim J,et al.Pulmonary fibrosis[J]. Internist (Berl),2010,51(1):6-13

[3]Kuwano K.Involvement of epithelial cell apoptosis in interstitial lung diseases[J].Intern Med,2008,47(5):345-353

[4]李玉花,许先荣,潘庆,等.大黄素对肺纤维化大鼠TGF-茁1及smad3/7信号通路的影响[J].中华中医药学刊,2010,28(2):346-347

[5]马荣林,王尉平,蒋小岗,等.黄芩总黄酮对博莱霉素致大鼠肺纤维化的干预作用[J].中国药理学通报,2011,27(4):537-542

[6]Feng YJ,Li YY.The role of p 38 mitogen-activated protein kinase in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J].J Dig Dis,2011,12 (5):327-332

[7]Scaldaferri F,Sans M,Vetrano S,et al.The role of MAPK in governing lymphocyte adhesion to and migration across the microvasculature in inflammatory bowel disease[J].Eur J Immunol,2009,39(1):290-300

收稿日期：（2015-03-23）

中图分类号：R563

文献标识码：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.08.009