松杨栅锈菌无性发育阶段组织学染色方法1)

于丹 曹支敏

(西北农林科技大学，杨凌，712100)

责任编辑:程 红。

杨树具有优质、速生、适应性强、易改良遗传等优点，因此被广泛用于木材、造纸、包装等多种行业，具有重要的经济、社会、生态效益［1］。松杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)是一种活体营养专性寄生真菌，必须从生活着的寄主细胞中获得所需的营养物质，才能正常生长和发育。该锈菌主要侵染青杨派、黑杨派及其杂交种的20 余种杨树，在世界范围内引起杨树叶锈病，严重危害幼苗和幼树，降低其生长量从而造成重大经济损失［2－4］。由于活体专性寄生特性，目前，松杨栅锈菌仍不能离开寄主组织进行培养。因此，利用组织病理学来研究该锈菌与寄主杨树的互作关系对于阐明病原菌的致病机理和寄主的抗病机制则尤为重要。一些学者利用Bruzzese整叶透明法研究过松杨栅锈菌与寄主杨树的互作关系［5－7］。本研究中笔者通过试验比较分析了荧光增白剂和偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素2 种荧光染色方法对松杨栅锈菌无性发育不同阶段的染色效果，筛选出较理想的染色方法，从而为解析该锈菌与杨树互作的分子机制提供有效的技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和杨树

供试菌种为松杨栅锈菌陕西渭河单孢菌系Wh03，由西北农林科技大学森林病理学实验室提供。用太白杨(Populus purdomii)作为繁殖寄主在温室人工扩繁，参照曹支敏等［8］的方法进行菌种的活化及保存。

供试杨树为感病品种中林美荷(P.deltoids×P.nigra，欧美杨品种)，采自西北农林科技大学林学院苗圃［4］。

1.2 试验方法

接种培养:3月份，采集中林美荷杨1年生的插条，盆栽于西北农林科技大学植物保护学院温室。5月份，选取生长状态基本一致的杨树健康叶片作为接种叶片，参照曹支敏等［8］的方法进行接种。用1～2 g·L－1的Wh03 菌系夏孢子悬浮液进行接种，以涂抹自来水的健康叶片作为对照。接种后置于保湿桶内保湿36 h，然后放在18～24 ℃的温室培养，于不同培养时间取样进行染色观察。

荧光增白剂荧光染色方法:将接种的叶片切成小片，置于含有1.5 g·L－1三氯乙酸的V(乙醇)∶V(氯仿)= 3 ∶1 固定透明液中，更换透明液至不变色，然后将小片转入饱和水合氯醛(2.5 g·mL－1)中至小片完全透明。参照康振生等［9］的方法，将透明好的样品置于荧光增白剂染料(Sigma－Aldrich，St.Louis，MO，USA)中避光染色5 min，用50%甘油做浮载剂，将染色样品转入载玻片中盖片封片，用OLYMPUS 荧光显微镜(BX52+DP72)观察松杨栅锈菌的无性发育不同阶段并拍照。

偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素染色方法:叶片的透明处理同荧光增白剂荧光染色方法。参照Ayliffe 等方法［10］并略作修改，用偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素(Wheat germ agglutinin－Alexa 488，Invitrogen，USA)避光处理20 min，用50%甘油做浮载剂，将染色样品转入载玻片中盖片封片，用OLYMPUS 激光共聚焦显微镜(FV1000)观察松杨栅锈病菌的无性发育不同阶段并拍照。

2 结果与分析

2.1 荧光增白剂荧光染色

固定透明后的样品经荧光增白剂染色处理，在紫外光激发下菌体可产生蓝色荧光，寄主组织同样产生蓝色荧光，因此呈现蓝色背景(图1)。借助这种染色方法可以较清楚地观察到松杨栅锈菌的夏孢子、萌发的芽管、附着胞和气孔下囊，但不易观察到叶肉细胞间隙扩展的侵染菌丝、吸器母细胞以及胞内的吸器结构(图1)。

图1 松杨栅锈菌无性发育阶段的荧光增白剂荧光染色结果

2.2 偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素荧光染色

染色结果(图2)表明，偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素与真菌细胞壁的特定组分结合，在一定条件激发下(激发光450～480 nm，发射光515 nm)菌体产生绿色荧光，而寄主组织不被染色，因此呈现出黑色背景，从而可明显地区分菌体与寄主。利用该方法可以较清楚地观察到松杨栅锈菌的夏孢子、萌发的芽管、附着胞、气孔下囊、侵染菌丝、吸器母细胞及吸器等结构。相比较荧光增白剂荧光染色方法，该方法更适用于染色观察叶肉细胞间隙扩展的侵染菌丝及伸入细胞内的吸器。

3 结论与讨论

荧光增白剂能够特异性结合纤维素和几丁质等葡聚糖，因此，植物和真菌的细胞壁均能够被染色［11］。所以，荧光增白剂染色处理后背景呈现类似的蓝色荧光，这在一定程度上会影响观察效果。本试验中荧光增白剂更适合于松杨栅锈菌侵染早期时的形态观察，可以对萌发的夏孢子以及穿透气孔后形成的气孔下囊进行观察，对之后发育过程的观察还存在一定的困难，即侵染菌丝、吸器母细胞及吸器等结构的观察效果不理想。相对偶联Alexa 488 荧光素的小 麦凝集素染色方法，该方法有待于进一步改进。

图2 松杨栅锈菌无性发育阶段的偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素荧光染色结果

小麦凝集素能够特异结合真菌细胞壁组分几丁质的成分N－乙酰氨基葡萄糖，因此该物质已经被广泛应用于真菌组织的染色观察［10］。几乎所有植物细胞壁中的多糖不含有N－乙酰氨基葡萄糖，因此被小麦凝集素染色处理后的植物组织不被染色。然而，也有研究表明小麦凝集素能够与小麦籽粒的表皮细胞壁和马铃薯导管的第2 层细胞壁结合，表明N－乙酰氨基葡萄糖可能也存在于某些植物细胞壁内部［12］。通过偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素染色，可以较全面地观察到松杨栅锈菌在杨树叶片中的不同发育阶段，不受寄主组织颜色的干扰，而且重复性较强。因此，该方法是研究松杨栅锈病菌与寄主杨树互作的一种可行的组织学病理学方法。

植物组织病理学研究是解析病原菌与寄主互作过程中病菌致病机理以及植物抗病机制的一种重要手段，荧光染色技术是其中一种研究方法。荧光增白剂染色方法和偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素染色方法在禾谷类锈菌研究中应用较为广泛［10，13－15］，然而目前尚未见报道使用这2 种染色方法观察松杨栅锈菌与杨树互作过程中病菌的形态结构。笔者通过试验发现偶联Alexa 488 荧光素的小麦凝集素染色方法可以较全面地观察到松杨栅锈菌在杨树叶片中的不同发育阶段，从而为研究该锈菌与杨树互作的分子机制以及病原菌致病分子机理提供了技术支持。

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