不同因素对吗啡诱导的小鼠CPP实验的影响

李晓丹，胡远艳，邴　晖，于树润，丁　青，罗素兰，长孙东亭

(海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海口市海洋药物重点实验室，海南 海口 570228)



不同因素对吗啡诱导的小鼠CPP实验的影响

李晓丹，胡远艳，邴晖，于树润，丁青，罗素兰，长孙东亭

(海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海口市海洋药物重点实验室，海南 海口 570228)

摘要：为了比较不同因素对吗啡诱导的小鼠条件性位置偏爱(CPP)实验模型的影响，以建立理想的CPP模型，本实验首先筛选出符合条件的小鼠来注射吗啡(5 mg·kg-1)，分为皮下注射和腹腔注射2种不同给药方式组，于不同给药时间组连续皮下注射吗啡3 d,5 d,7 d，并于不同测试时间(15 min或30 min)组，分别对小鼠进行CPP训练，然后进行测试，同时以小鼠在伴药箱(白箱)的活动时间为指标进行比较.结果表明：皮下注射和腹腔注射生理盐水组与吗啡组相比较，均存在极显著性差异(P<0.001)；皮下注射吗啡组与腹腔注射吗啡组的差异性不显著(P>0.05)，连续给药3 d,5 d,7 d均能成功建立CPP模型(P<0.001)，CPP训练后，3 d吗啡组与5 d、7 d吗啡组相比较，均存在极显著差异(P<0.001)，5 d与7 d吗啡组相比较，则存在显著性差异(P<0.05).在连续给药5 d的基础上，不同测试时间(15 min与30 min)吗啡组与生理盐水组相比较，小鼠在伴药箱的活动时间具有极显著差异性(P<0.001).由此得出结论：皮下注射和腹腔注射2种给药方式对吗啡诱导的小鼠CPP模型的建立无影响；连续注射5 d所建立的CPP模型更稳定，更经济，更理想；测试时间为 15 min时更省时，更具代表性.

关键词：条件性位置偏爱(CPP)； 吗啡； 小鼠； 影响因素

条件性位置偏爱(conditioned place preference, CPP)模型是根据巴甫洛夫的条件反射学说建立的，是研究药物精神依赖性的重要模型之一[1]，它对深入研究药物依赖的特征、开发治疗成瘾的药物、探索形成药物依赖的机制、以及指导临床的脱毒治疗等具有十分重要的意义.CPP模型训练周期短，操作简单，无药状态的监测能排除药物对检测结果的干扰.但是， 目前CPP模型的建立尚无统一的标准，各种实验因素，包括动物种类、药物剂量、给药途径、给药时程、用药时间等的不同, 都会在不同程度上影响实验研究的可靠性和准确性.CPP实验装置、药物( 吗啡、可卡因) 剂量等多方面对CPP模型建立的影响已有报道[2-4].国内文献所报道的多数是通过连续数天每天注射药物或生理盐水各1次，并且2次给药的时间间隔为8 h的实验方案来建立吗啡CPP模型[5-7].在此基础上，本研究比较了不同给药方式、给药时程、测试时间等关键因素对吗啡所诱导的小鼠CPP模型的影响，以期选择最佳的实验条件来建立理想的吗啡诱导的小鼠CPP模型，从而为后续用于戒烟或戒毒芋螺毒素的海洋药物的研发提供整体的动物模型，同时也为其他来源的化合物提供药效筛选的模型.

1材料与方法

1.1　材　料

1.1.1试验动物昆明种小鼠(20～25 g)，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002.在标准环境下随机分笼饲养( 7:00—19:00，明暗交替条件下饲养)，试验期间自由饮水和摄食.

1.1.2药物盐酸吗啡注射液，青海制药厂生产，批号：951030，用生理盐水配制成所需的浓度.

1.1.3仪器条件性位置偏爱(CPP)试验装置(上海吉量公司生产的视频跟踪-计算机自动分析系统)，该装置由一块中间隔板(一端有开口，供动物自由穿梭)将箱体分割成两部分，分别为白箱和黑箱.试验动物进入装置后，该装置顶部的摄像系统将监视其行为活动，并由计算机记录保存.

1.2　方　法

1.2.1吗啡诱导的小鼠CPP模型的建立按照通用方法建立吗啡诱导的小鼠CPP模型，分为预处理、训练和测试3个阶段.具体如下.

预处理阶段：实验开始第1天，小鼠被放置在两箱中间，可任其自由穿梭，记录小鼠一定时间内在各箱活动的时间.试验采取的是倾向性试验程序，淘汰在黑箱时间百分比低于50%的小鼠，以小鼠在非偏爱的白箱作为伴药箱进行试验.

训练阶段：将符合条件的小鼠随机分为不同实验组，连续数天于早上8：00，对吗啡模型组的小鼠注射吗啡(5 mg·kg-1)，同时将对照组的小鼠注射同体积的生理盐水后放入伴药箱(白箱)，使其不可自由穿梭，持续时间为40 min；下午16：00，均注射等体积的生理盐水后，放入黑箱，持续时间仍为40 min.

测试阶段：即停止给药24 h后，将小鼠放置在两箱中间，可任其自由穿梭活动，记录小鼠一定时间内在伴药箱活动的时间.

1.2.2不同因素对吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的影响在一般设计程序的基础上，采用单因素试验设计的方式，对影响吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的各个因素进行优化，包括给药方式、给药时程、测试时间，以确立最佳的因素组合，用于CPP模型的建立.各试验设计方法见表1 ，具体步骤如下.

不同给药方式：将符合条件的小鼠随机分为皮下注射(subcutaneous，s.c.)生理盐水对照组、吗啡模型组以及腹腔注射( intraperitoneal，i.p.)生理盐水对照组、吗啡模型组，每组8只，连续训练5 d，测试时间为15 min.

不同给药时程：将达到条件的小鼠随机平均分为3 d组、5 d组和7 d组，每组8只, 并采用皮下注射的方式连续训练3 d、5 d、7 d，测试时间为15 min.

不同测试时间：将达到条件的小鼠随机平均分为3 d组，15 min组、30 min组；5 d，15 min组、30 min组，每组8只，同时采用皮下注射的方式连续训练5 d，测试时间分别为15 min 或30 min.

表1　不同因素影响吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的试验设计

1.3统计学处理数据以Mean±SEM表示，用GraphPad Prism 5 软件进行数据统计分析与作图；同时采用单因素方差分析，分析比较各组动物在伴药箱中的活动时间；计算训练前后小鼠在伴药箱活动时间的增幅百分数，计算公式为：[(训练后小鼠在伴药箱的活动时间-训练前小鼠在伴药箱的活动时间)/训练前小鼠在伴药箱的活动时间]× 100 %，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异.

2结果与分析

2.1不同给药方式对吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的影响对于CPP训练前小鼠在伴药箱的活动时间，皮下注射和腹腔注射吗啡组与相应的生理盐水组都在350~370 s 的范围内，在它们之间进行比较，统计分析显示无显著性差异(P>0.05).而在CPP训练后，小鼠在伴药箱的活动时间却显示，无论是皮下注射，还是腹腔注射，吗啡组小鼠的活动时间范围为 617~635 s，而生理盐水组的小鼠，其活动时间范围为 364~374 s，吗啡组小鼠的活动时间明显长于生理盐水组，且它们之间的差异达到了极显著水平(P< 0.001)，因而皮下注射和腹腔注射吗啡这两种给药方式都能建立合格的小鼠CPP模型，它们的效果相等(见表2和图1).因此，皮下注射和腹腔注射这两种注射方式对吗啡诱导的小鼠CPP模型的建立没有影响.

2.2不同给药时程对吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的影响CPP训练前后小鼠在伴药箱的活动时间，不同给药时程(3 d、5 d、7 d)吗啡组与生理盐水组的比较结果见表3和图2. 6组小鼠于CPP训练前在伴药箱的活动时间均在283～301 s的范围内，它们之间在训练前的偏爱性是没有差异的(P>0.05).在CPP训练后，3 d、5 d和7 d吗啡组的小鼠在伴药箱的活动时间显著延长，对于3 d吗啡组的小鼠，其活动时间在424 s 左右，3 d生理盐水组的小鼠，其活动时间在284 s左右；5 d吗啡组的小鼠，活动时间在630 s左右，5 d生理盐水组的小鼠，活动时间在298 s左右；7 d吗啡组的小鼠，活动时间在566 s左右，7 d生理盐水组的小鼠，活动时间在289 s左右.将3个吗啡组与其相应的生理盐水组的小鼠偏爱性进行比较，结果都存在极显著差异(P<0.001)，这说明采用3 d、5 d、7 d这3个不同给药时程均能建立小鼠CPP模型.当对这3个吗啡组进行统计分析时，在3 d吗啡组与5 d和7 d吗啡组之间小鼠偏爱性存在极显著性差异(P<0.001)，5 d和7 d吗啡组的小鼠于CPP训练后，其在伴药箱的活动时间存在显著性差异(P<0.05).结果显示：连续给药5 d所建立的吗啡诱导的小鼠CPP模型的偏爱性最高，而且最稳定、最经济和最理想.

2.3不同测试时间对吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的影响在给药3 d和5 d的两种条件下，分别研究了15 min、30 min这两种测试时间对小鼠CPP模型建立的影响.在给药3d的条件下(见表4，图3)，对于CPP训练前后小鼠在伴药箱的活动时间，不同测试时间(15 min、30 min)吗啡组与生理盐水组间均具有差异显著性，这说明无论是测试15 min，还是30 min，都能体现出小鼠CPP模型的建立是成功的.测试时间为15 min的吗啡组与生理盐水组，于训练前小鼠在伴药箱的活动时间为 283～300 s，训练后吗啡组的小鼠在伴药箱的活动时间提高到 424 s左右，而训练后生理盐水组的小鼠在伴药箱的活动时间几乎没有变化，在286 s左右.测试时间为15 min的吗啡组小鼠比生理盐水组小鼠的活动时间延长了约51%.对于测试时间为30 min的吗啡组与生理盐水组，于训练前小鼠在伴药箱的活动时间介于719～731 s之间，训练后吗啡组的小鼠在伴药箱的活动时间提高到1 131 s左右，而训练后生理盐水组的小鼠在伴药箱的活动时间同样几乎没有变化，在726 s左右.测试时间为30 min的吗啡组小鼠比生理盐水组小鼠的活动时间延长了约58%(见表4，图3).在测试时间为15 min和30 min的吗啡组之间，于训练前后其小鼠在伴药箱的活动时间的增幅没有显著性差异.

在给药5 d的条件下(见表5，图4)， 对于CPP训练前后小鼠在伴药箱停留的时间，不同测试时间(15 min、30 min)吗啡组与生理盐水组相比较，都具有极显著差异性(P<0.001)，说明无论是测试15 min，还是30 min，在给药5 d的情况下，小鼠CPP模型的建立是最成功的.对于测试时间为15 min的吗啡组与生理盐水组，于训练前小鼠在伴药箱停留的时间在290～296 s 之间，训练后吗啡组的小鼠在伴药箱停留的时间提高到 630 s左右，而训练后生理盐水组的小鼠在伴药箱停留的时间没有太大变化，平均在298 s左右；测试时间为15 min的吗啡组小鼠比生理盐水组小鼠的停留时间延长了约119%.对于测试时间为30 min的吗啡组与生理盐水组，于训练前小鼠在伴药箱停留的时间在747～803 s之间，训练后吗啡组小鼠在伴药箱停留的时间提高到 1342 s左右，而训练后生理盐水组的小鼠在伴药箱停留的时间同样几乎没有变化，在763 s左右.测试时间为30 min的吗啡组小鼠比生理盐水组小鼠停留的时间延长了约67%(见表5，图4).对于测试15 min和30 min的吗啡组，于训练前后其小鼠在伴药箱停留的时间增幅存在极显著性差异，也就是说，测试15 min的吗啡组小鼠比测试30 min的吗啡组小鼠所表现出的偏爱性更高，更灵敏.

3讨论与结论

对吗啡类药物的依赖是由于滥用该类药物所形成的复杂而异常的行为性疾病，它是不同个体受遗传因素和社会环境因素综合作用的结果[8].迄今为止，吗啡类药物导致依赖性的机理还未被完全阐明，在临床上亦缺乏有效的治疗成瘾的药物.因而，建立动物的吗啡依赖性模型是研究吗啡依赖发生机制、以及研发戒烟或戒毒新药过程中很关键的一步.条件性位置偏爱(CPP) 实验模型是一种广泛应用于药物奖赏以及药物渴求研究的动物模型.但是，由于目前国内外研究中所选择的试验条件均不一致，模型的建立尚无统一的标准，各种试验因素的不同，如动物种类、药物剂量、给药途径、给药时间、用药时间、给药次数、实验箱的选择、条件线索的设立等不同，都会在不同程度上影响整个试验研究的可靠性和准确性[9]，为此，不同实验室应该在参照以往实验经验的基础上，合理地设计，使条件性位置偏爱模型能更准确地应用到药物成瘾研究中.本实验研究了皮下注射和腹腔注射2种不同给药方式，不同给药时程(3 d、5 d、7 d)及不同测试时间(15 min和30 min)对吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的影响，并利用优化的实验条件，建立了重复性好、敏感度高、稳定而经济的CPP动物模型，它可为本实验室后续海洋药物(如用于戒烟或戒毒芋螺毒素的药物)的研发提供实验模型，同时它也可为其他来源的化合物提供抗成瘾药物的筛选模型.

注射吗啡后小鼠会出现竖尾反应，这是鉴别药物成瘾的一种简易方法[10]，因为小鼠的竖尾反应与毒品成瘾有一定的平行关系[11]，对于成瘾性强的药品，如鸦片、海洛因、吗啡、冰毒等，小鼠的竖尾指数较大；而对于成瘾性弱的药品，如可待因、K粉等，小鼠的竖尾指数则较小.在本试验中，于注射完吗啡15 min后，小鼠出现竖尾，非常兴奋并且不停走动，历经2 h左右才趋于正常，这与所文献报道的相类似.由于小鼠批次不同，相同的处理组在训练前后小鼠在伴药箱的活动时间会有所差异，但由于本实验采用的是单因素试验设计的方式，所以该差异对本实验无影响.

根据文献记载[2]，给药方式对CPP模型的建立有影响，以皮下注射和腹腔注射较为常见.本实验通过皮下注射和腹腔注射两种给药方式建立了吗啡诱导的小鼠CPP模型，结果显示，连续5 d皮下注射或者腹腔注射吗啡(5 mg/kg) ，均可成功地诱导和训练小鼠建立CPP模型.然而，腹腔注射时，容易出现意外，例如：注射入膀胱、针头扎伤内脏等，这都会影响试验结果，皮下注射则相对简单且易操作；因此，对于不同给药方式组和不同测试时间组，均可采用皮下注射法.所以，在根据实验室条件的基础上，可以自由选择皮下注射或者腹腔注射法，而本实验室多采用皮下注射法.

根据文献报道[12]，一次注射定量的吗啡不易成瘾，而分次注射一段间后则容易成瘾.国内一般多选用连续给药数天，如每天上午和下午分别注射吗啡和生理盐水(间隔8 h),因此，给药时间与吗啡诱导的小鼠CPP模型的建立有相关性.本实验选择了不同的给药时间，并将其分为3组，即3 d组、5 d组和7 d组，观察了其对吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的影响，目的是为了选择最佳的给药时程.实验结果显示：3 d组、5 d组和7 d组均可建立CPP模型，然而3 d与5 d比较，3 d所建立的CPP模型不够稳定，7 d与5 d比较，7 d所建立的CPP模型其效果不够显著，且耗时长，所需吗啡较多，不够经济.所以，连续给药5 d所建立的吗啡诱导的小鼠CPP模型最稳定、最经济、最理想，因此，在比较不同测试时间时仅连续训练3 d 和5 d.

目前，在动物CPP 实验环境中通常采用活动时间和活动距离两种行为指标来监测CPP模型的建立效果[13].对于测试时间， 有文献报道，过长的测试时间会引起CPP条件反应的消退[14].为此，本实验通过不同的测试时间(15 min和30 min)来记录吗啡诱导的小鼠CPP模型建立的效果，结果显示：测试时间为30 min与15 min时，均能显示CPP模型的成功建立，在连续给药3 d的基础上，二者无明显差异，在连续给药5 d的基础上，测试时间为15 min的吗啡组小鼠，其偏爱性更灵敏，且它与测试时间为30 min的吗啡组小鼠之间存在极显著差异.因而，选用连续注射吗啡5 d和测试时间为15 min来建立CPP模型，且以来建立的模型更省时、偏爱性更显著、更具代表性.

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Effects of Different Factors on Morphine-induced Conditioned Place Preference of Mice

Li Xiaodan, Hu Yuanyan, Bing Hui, Yu Shurun, Ding Qing, Luo Sulan, Zhangsun Dongting

(Key Laboratory of Tropical Biological Resources, Ministry of Education; Key Lab for Marine Drug of Haikou, Hainan University, Haikou 570228,China)

Abstract：To compare the effects of the different experimental conditions on morphine-induced conditioned place preference of mice and establish satisfactory CPP model, in the report, the eligible mice injected with morphine (5mg/kg) were divided into different groups random for conditioned place preference (CPP) training according to intraperitoneal injection (i.p.) or subcutaneous injection (s.c.); 3 d, 5 d, and 7 d different continuous injection time; and 15 min or 30 min different testing time. Each group mice received an injection of morphine (5mg/kg) or saline, and then, the time spent in the drug-paired box was observed. The results indicated that it was obvious that morphine groups significantly induced CPP effect after training, but no CCP effects occurred in saline groups, whatever it was s.c. or i.p. injection (P<0.001). CPP model could be constructed through 3d, 5d, or 7d different continuous injection of morphine, the differences among these groups were significant. The time spent in drug-paired box was significant difference between 15 min and 30 min testing time based on 5 d continuous injection of morphine (P<0.01). These results suggested that the different injection s.c. or i.p. has no effects on morphine induced CPP model of mice; 5d continuous injection is the most stable, economical, and ideal condition for the construct of the morphine-induced CPP mice model; the test time of 15 min is the most time-saving and most representative.

Keywords：Conditioned place preference (CPP); Morphine; Mice; Experimental factors

中图分类号：R 964

文献标志码：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2015.0026

文章编号：1004-1729(2015)02-0141-06

收稿日期：------------------------ 2015-12-08基金项目： 国家自然科学基金(41366002)；海南省社会发展科技专项(SF201328); 海口市重点科技计划项目(2013-16)；长江学者和创新团队发展计划(IRT1123)资助.

作者简介：李晓丹(1990-)，女，汉，山西运城，2013级硕士研究生，研究方向：海洋药物，E-mail:lixiaodan816@163.com通信作者： 长孙东亭， 男，副研究员，研究方向：海洋药物，E-mail: zhangsundt@163.com