肝胆两益汤对失眠模型大鼠不同脑区中单胺类神经递质的影响

2015-03-08张岗强北京卫生职业学院北京0005北京中医药大学北京0009首都医科大学中医药学院北京00069解放军总医院临床药理研究室北京0085

中国药物应用与监测 2015年4期

关键词：失眠

王燕，张岗强，张楠，刘屏（.北京卫生职业学院，北京 0005；.北京中医药大学，北京 0009；.首都医科大学中医药学院，北京 00069；.解放军总医院临床药理研究室，北京 0085）

王燕1，张岗强2，张楠3，刘屏4
（1.北京卫生职业学院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029；3.首都医科大学中医药学院，北京 100069；4.解放军总医院临床药理研究室，北京 100853）

[摘要]目的：研究经典古方肝胆两益汤治疗失眠症的作用机制，为临床合理使用肝胆两益汤提供参考。方法：将56只SD大鼠随机分为正常组、模型组、地西泮组（0.001 g·kg-1）、百乐眠组（0.215 g·kg-1）和肝胆两益汤低剂量组（0.925 g·kg-1）、中剂量组（1.850 g·kg-1）和高剂量组（3.700 g·kg-1），采用连续腹腔注射对氯苯丙氨酸（0.3 g·kg-1）造失眠大鼠模型，灌胃肝胆两益汤治疗，运用高效液相-荧光检测器，检测大鼠皮层、海马、纹状体、下丘脑和脑干内5-HT、DA和NE的含量。结果：与正常组相比，模型组大鼠皮层、海马、纹状体、下丘脑和脑干内5-HT含量显著降低（P < 0.01），下丘脑DA含量显著降低（P < 0.05），纹状体和下丘脑NE含量升高（P < 0.05）。经灌胃给予肝胆两益汤治疗后大鼠海马、皮层、纹状体和下丘脑内5-HT含量与模型组相比显著提高，下丘脑内NE含量与模型组相比显著降低（P < 0.05），其中最佳剂量为1.850 g·kg-1。结论：肝胆两益汤可调节机体神经内分泌系统，具有显著的镇静催眠和治疗失眠的作用。其对失眠治疗的可能作用机制是通过增加脑中5-HT含量和降低下丘脑内NE含量。

[关键词]失眠；肝胆两益汤；单胺类神经递质

Effect of Gandanliangyitang on monoamine neurotransmitter in different brain regions of insomnia model of rats

WANG Yan1, ZHANG Gang-qiang2, ZHANG Nan3, LIU Ping4
(1. Beijing Health Vocational College, Beijing 100053, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 3. Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100069, China; 4. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT] Objective: To study the mechanism of Gandanliangyitang (GDLYT) in the treatment of insomnia and provide reference for clinical use. Methods: A total of 56 SD rats were randomly divided into normal group, model group, diazepam group (0.001 g·kg-1), Bailemian group (0.215 g·kg-1) and GDLYT low dose group (0.925 g·kg-1), middle dose group (1.850 g·kg-1) and high dose group (3.700 g·kg-1). The model of insomnia rats was made successfully by using continuous intraperitoneal injection of parachlorophenylalanine (0.3 g·kg-1). The contents of 5-HT, DA and NE in cortex, hippocampus, corpus striatum, hypothalamus and brainstem of rats were detected by using high performance liquid chromatography with fluorescence detector. Results: Compared with normal group, in model group, the content of 5-HT in rat cortex and hippocampus, striatum, hypothalamus and brainstem significantly decreased (P < 0.01), DA content in the hypothalamus significantly decreased (P < 0.05), NE content increased in striatum and hypothalamus (P < 0.05). Compared with the model group, in GDLYT treatment group, the content of 5-HT in hippocampus, cortex, striatum and hypothalamus increased significantly, NE content in hypothalamus significantly decreased (P < 0.05). The best dose is 1.850 g·kg-1. Conclusion: GDLYT plays remarkable role on sedative hypnotic, the treatment mechanism of insomnia is probably by increasing the 5-HT content in the brain and decreasing the content of NE in hypothalamus, regulating neuroendocrine system.

[KEY WORDS] Insomnia; Gandanliangyitang; Monoamine neurotransmitter

失眠是一种影响健康的常见疾病，不仅影响人类白天正常的工作和生活，还会诱发精神类等疾病，给社会和个人造成极大的负担。失眠的中医证候分布以肝郁化火和心脾两虚为主，初期以肝郁化火为主，后期则以心脾两虚为主，病机演变过程具有由肝郁化火证→痰热内扰证→心脾两虚证的演变规律[1]。《辨证录》中记载的“肝胆两益汤”由白芍一两，远志五钱，炒枣仁一两组成。白芍入胆，佐以远志、枣仁者，既能入心，亦能入胆，则共走胆经，用于治疗“夜不能寐，恐鬼祟来侵，辗转不安或少睡而即惊醒，或再睡而恍如捉拿”等症。临床上主要应用于失眠症的治疗，可有效减少多梦和夜间惊醒次数。本文通过测定各组大鼠不同脑区内单胺类神经递质的含量，研究肝胆两益汤治疗失眠的作用机制，以期在中药治疗失眠上寻求更好的途径。

1　材料

1.1实验动物

SD大鼠56只，雄性，体质量180 ~ 220 g，由解放军总医院实验动物中心提供，合格证号：SCXK（京）2011-0004。

1.2实验药物与仪器

肝胆两益汤提取物，取炒酸枣仁破碎，加入其它两味饮片，加水煎煮3次，每次1 h，合并煎煮液，水浴浓缩，加入乙醇，使醇含量达到50%，滤过，取上清液，回收乙醇并浓缩至浸膏，真空减压干燥（60 ℃）得干膏，粉碎得干粉。每克干粉相当于4.6 g原生药材。本品由中国中医科学院提供，批号：20120703。对氯苯丙氨酸（PCPA），5-羟色胺（5-HT）对照品，多巴胺（DA）对照品，去甲肾上腺素（NE）对照品，均由Sigma公司提供。

1200型Agilent高效液相色谱仪（Agilent公司）；G1321A荧光检测器（Chemstation色谱工作站，Agilent公司）；3K15型高速冷冻离心机（Sigma公司）；F-30型pH计（北京屹源电子仪器科技公司）；多种规格移液器（Eppendorf公司）；KQ-250E型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

2　方法

2.1PCPA失眠模型的建立

SD大鼠56只，随机分为正常组、模型组、地西泮组（0.001 g·kg-1）、百乐眠组（0.215 g·kg-1）和肝胆两益汤低剂量组（0.925 g·kg-1）、中剂量组（1.850 g·kg-1）和高剂量组（3.700 g·kg-1），每组8只。除正常组外，其余各组大鼠每日上午9：00 ~ 9：30腹腔注射PCPA 0.3 g·kg-1，连续注射2 d，正常组腹腔注射与PCPA同体积的弱碱性0.9%氯化钠注射液。整体观察，第一次腹腔注射PCPA 28 ~ 30 h后，动物出现昼夜节律消失，白天也活动不停，攻击性增强，与正常组有明显差异。

连续两天腹腔注射PCPA后大鼠运动总路程见表1，结果显示模型组、地西泮组、百乐眠组和肝胆两益汤低、中、高剂量组大鼠在大鼠笼内30 min自主运动总路程与正常组相比均有显著升高（P < 0.05），说明失眠模型建立成功。

表1　连续两天腹腔注射PCPA后大鼠30 min运动总路程.± sTab 1 The movement distance in 30 minutes after consecutive intraperitoneal injection of PCPA for two days in rats.± s

注：与正常组比较，*P < 0.05Note: compared with the normal group,*P < 0.05

组别　例数　运动总路程/m正常组　8　16.786±5.981模型组　8　27.348±10.235*地西泮组　8　25.180±7.002*百乐眠组　8　28.304±9.022*低剂量组　8　23.481±5.989*中剂量组　8　27.421±9.515*高剂量组　8　24.076±7.262*

2.2给药方法

于第2次腹腔注射PCPA后，按照10 mL·kg-1体重灌胃给药，正常组给予蒸馏水，地西泮组、百乐眠组和肝胆两益汤低、中、高剂量组分别灌胃给予相应浓度的药物连续7 d。

2.3组织样品的采集

将各组大鼠给药第6天晚上22：00开始禁食不禁水，第7天早上8：00各组大鼠给药50 min后进行自主运动视频录制，而后用水合氯醛腹腔注射麻醉后眼眶取血，断头处死，于冰上迅速剥离大鼠海马、皮层、纹状体、下丘脑和脑干，称重并用锡纸包好，迅速置于液氮中保存，血液室温静止1 h后，在4 ℃冷冻离心机上3500 r·min-1离心30 min，取上清即为大鼠血清，然后放于– 80 ℃冰箱保存。

2.4组织提取液的配制

精确取EDTA-Na20.053 3 g、L-半胱氨酸 0.1 g和高氯酸0.787 mL，用100 mL容量瓶定容至100 mL，避光4 ℃保存，备用。

2.5组织样本的制备

取冻存的大鼠海马、皮层、纹状体、下丘脑和脑干组织称重，按照4 μL·mg-1比例加入组织提取液，冰浴匀浆后冰浴超声20 min，加入2倍组织重量的90 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液，涡旋混匀后在15 000 r·min-1，4 ℃条件下离心15 min，临用前取上清液过0.45 μm滤膜。

2.6对照品储备液制备

精密称取5-HT、DA、NE对照品各5.0 mg，用组织提取液分别溶解定容至5 mL，摇匀，为1 mg·mL-1各对照品储备液。从各对照品储备液中分别吸取适量，用提取液稀释成5000、1000、500、100、50、10 ng·mL-1的溶液作为混合对照品溶液，避光，4 ℃保存，临用前经0.45 μm滤膜滤过。

2.7统计学分析

采用SPSS13.0软件对数据进行分析，实验数据采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnett's后检验，计量资料数据用（± s ）表示，以α=0.05作为检验水准。

3　结果

3.1HPLC检测单胺类神经递质图谱

色谱图具体见图1。

图1　单胺类神经递质HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of monoamine neurotransmitter

与混合对照品HPLC色谱图比较，给药肝胆两益汤的失眠大鼠脑组织NE、DA、5-HT含量发生改变。

3.2对照品标准曲线

以各组分对照品溶液浓度为纵坐标（Y），各组分对照品的峰面积为横坐标（X）绘制标准曲线，见表2。

表2　单胺类神经递质标准曲线Tab 2 Standard curve of monoamine neurotransmitter

3.3各组大鼠皮层中单胺类神经递质的含量

与正常组比较，模型组大鼠皮层5-HT含量明显降低，差异具有显著统计学意义（P < 0.01），而NE和DA含量均没有显著性改变（P > 0.05）；与模型组比较，百乐眠组和肝胆两益汤低、中、高剂量组大鼠皮层5-HT含量明显升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。提示肝胆两益汤各剂量组具有对抗失眠大鼠皮层中5-HT含量降低的作用，其中最佳剂量为1.850 g·kg-1。详见表3。

表3　肝胆两益汤对失眠模型大鼠皮层DA、NE、5-HT的影响.± s，n=8Tab 3 Effect of Gandanliangyitang on cortex DA, NE, 5-HT in a rat model of insomnia.± s , n=8

注：与正常组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01; compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01

组别　剂量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常组　–　 200.4±59.3 18.2±6.3　 8.8±3.4模型组　–　 172.0±32.2 18.3±3.0　 2.7±1.1##地西泮组　0.001　 168.8±50.4 16.5±4.5　 2.8±1.0百乐眠组　0.215　 183.0±26.6 19.5±6.3　 5.6±1.2*低剂量组　0.925　 180.4±40.1 18.2±3.4　 5.2±2.5*中剂量组　1.850　 215.2±51.2 17.9±2.1　 9.0±2.6**高剂量组　3.700　 175.1±40.9 18.1±3.8　 5.3±1.4*

3.4各组大鼠海马中单胺类神经递质的含量

与正常组比较，模型组大鼠海马5-HT含量明显降低，差异有显著统计学意义（P < 0.01），而NE含量没有显著性改变（P > 0.05）；与模型组比较，肝胆两益汤中、高剂量组大鼠海马中5-HT含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。由于检测器的缘故，海马中DA含量低于最低检测限，无法测定其含量，故在此未列出，提示肝胆两益汤具有对抗失眠大鼠海马中5-HT含量降低的作用。详见表4。

表4　肝胆两益汤对失眠模型大鼠海马NE、5-HT的影响.　± s，n=8Tab 4 Effect of Gandanliangyitang on hippocampus NE, 5-HT in a rat model of insomnia.± s , n=8

组别　剂量/g·kg-1　NE/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常组　–　242.9±50.2　 7.4±0.2模型组　–　242.4±57.6　 4.3±1.2# #地西泮组　0.001　244.7±62.6　 5.1±2.0百乐眠组　0.215　232.9±70.0　 4.9±1.0低剂量组　0.925　239.4±79.5　 4.7±1.4中剂量组　1.850　235.2±58.7　 6.0±0.9*高剂量组　3.700　239.9±58.3　 6.2±1.0**

3.5各组大鼠下丘脑中单胺类神经递质的含量

与正常组比较，模型组大鼠下丘脑NE含量显著升高（P < 0.05），DA及5-HT含量显著降低（P < 0.01）。与模型组比较，地西泮组、百乐眠组和肝胆两益汤低、中、高剂量组大鼠下丘脑NE含量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；地西泮组和肝胆两益汤低、中、高剂量组与模型组相比5-HT含量明显升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。详见表5。

表5　肝胆两益汤对失眠模型大鼠下丘脑NE、DA和5-HT的影响.± s ，n=8Tab 5 Effect of Gandanliangyitang on hypothalamus NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

注：与正常组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；与模型组比较，*P < 0.05,**P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01; compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01

组别　剂量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常组　–　 106.5±17.0　237.8±49.1　 7.4±1.5模型组　–　 137.6±24.8#　133.7±35.5##2.6±1.6##地西泮组　0.001 113.7±25.9*　144.8±42.3　 5.0±1.8*百乐眠组　0.215 113.2±13.3*　137.7±84.3　 3.8±1.0低剂量组　0.925 109.5±11.3*　108.0±92.8　 4.4±1.1*中剂量组　1.850 106.2±21.2*　131.7±68.8　 4.5±1.2*高剂量组　3.700 101.7±24.8*　139.9±38.3　 5.4±1.6**

3.6各组大鼠纹状体中单胺类神经递质的含量

与正常组比较，模型组大鼠纹状体NE含量显著升高（P < 0.05），DA含量没有显著变化（P > 0.05），5-HT含量显著降低（P < 0.01）。与模型组比较，各个给药组对NE含量均没有显著性影响；肝胆两益汤低、中、高剂量组与模型组相比5-HT含量明显升高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。详见表6。

表6　肝胆两益汤对失眠模型大鼠纹状体NE、DA和5-HT的影响.± s ，n=8Tab 6 Effect of Gandanliangyitang on the corpus striatum NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

组别　剂量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常组　–　278.8±98.1　 20 655.5±3 891.0 4.3±1.2模型组　–　498.9±124.3#18 127.3±2 784.0 1.9±0.6##地西泮组　0.001　552.0±156.9 16 261.6±2 549.0 1.7±0.5百乐眠组　0.215　569.6±190.1 17 667.0±2 354.0 4.2±0.9**低剂量组　0.925　597.5±188.3 16 198.8±2 738.0 3.1±0.7*中剂量组　1.850　464.7±123.5 15 431.6±2 066.0 2.6±0.5*高剂量组　3.700　535.4±178.9 15 055.0±2 197.0 4.2±0.8**

3.7各组大鼠脑干中单胺类神经递质的含量

与正常组比较，模型组大鼠脑干NE含量有所升高，DA含量有所降低，但均无统计学意义（P > 0.05），5-HT含量显著降低（P < 0.01）。与模型组比较，各个给药组对NE、DA和5-HT含量均没有显著性影响（P > 0.05）。详见表7。

表7　肝胆两益汤对失眠模型大鼠脑干NE、DA和5-HT影响.　± s ，n=8Tab 7 Effect of Gandanliangyitang on brainstem NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

注：与正常组比较，#P < 0.05，##P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01

组别　剂量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常组　–　194.9±52.9　996.3±103.3　7.2±1.7模型组　–　255.2±65.9　974.4±171.2　4.1±1.8##地西泮组　0.001　277.4±98.3 1 005.0±94.5　5.0±2.1百乐眠组　0.215　282.2±102.6　940.2±150.5　4.9±1.2低剂量组　0.925　238.3±82.5　1 100.0±295.6　4.6±2.3中剂量组　1.850　261.5±81.9　985.8±260.2　4.4±1.5高剂量组　3.700　239.5±84.2　1 153.9±118.2　5.2±2.4

4　讨论

5-HT对于睡眠的发生和维持起到关键性的作用，主要存在纹状体中，其次为基底节、下丘脑、黑质、垂体及新皮层[2]。用PCPA抑制脑内5-HT合成时能引起动物的完全性失眠，且因5-HT耗竭而导致动物脑内其他单胺类神经递质含量发生紊乱，大鼠腹腔注射PCPA 28 ~ 30 h后，昼夜睡眠节律消失，白天也活动不停，而给予5-HT前体物5-羟色氨酸后，动物完全恢复正常睡眠[3]。5-HT对于睡眠的发生和维持主要与慢波睡眠（SWS）有关，以电流直接损毁动物中缝核5-HT能神经元时，SWS消失[4]。DA主要存在前额叶皮层、杏仁核、嗅球、海马、丘脑和中脑[5]，脑内DA浓度增高时，脑电波出现低幅快波，即兴奋性的表现[6]。中枢NE对中枢神经既有兴奋又有抑制作用，但主要以兴奋作用为主，可降低大脑皮质的兴奋性[7]。其各自含量的平衡对于睡眠的调节起到至关重要的作用，大脑的各个部位对于睡眠的调节有不同的作用，其中海马、纹状体、下丘脑、脑干和皮层中都含有与睡眠密切相关的单胺类神经递质[8]。

本实验结果显示，连续两天腹腔注射PCPA造失眠模型成功后，大鼠皮层、海马、纹状体、下丘脑和脑干中5-HT水平较正常组显著降低；下丘脑部位DA含量显著降低；下丘脑和纹状体部位NE含量显著升高。提示PCPA造失眠模型时，主要影响的是5-HT含量，所检测脑各部位的5-HT含量均有一定程度的降低，伴随5-HT含量降低，DA和NE的含量也有一定程度的改变。因此，可推测PCPA失眠模型在5-HT耗竭的同时伴随着纹状体和下丘脑部位DA和NE的改变，从而导致失眠大鼠脑内单胺类神经递质紊乱而失眠。

·临床药师园地·

[作者简介]王燕，女，讲师，研究方向：中药药理。E-mail：mandy_wang_2004@163.com

[通信作者]刘屏，女，研究员，研究方向：中药药理学。E-mail：liuping301@126.com

[基金项目]军队中医药科研专项课题（10ZYZ141）

[中图分类号]R96

[文献标识码]A

[文章编号]1672 – 8157(2015)04 – 0215 – 05