HPLC-MS/MS法测定人尿液中戊乙奎醚的浓度

黄 娟，雍小兰*，冯仕银，王蓝天，李 楠，杜晓琳



HPLC-MS/MS法测定人尿液中戊乙奎醚的浓度

黄 娟1,2，雍小兰1,2*，冯仕银2，王蓝天2，李 楠2，杜晓琳2

目的 建立测定人尿液中戊乙奎醚浓度的HPLC-MS/MS法。方法 尿样经稀释，离心后取上清液进行HPLC-MS/MS测定。色谱柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP (4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相：5 mM醋酸铵(甲酸调pH 5.5)-甲醇(35∶65，v/v)，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量10 μL。采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式多重反应选择离子检测(MRM)。戊乙奎醚和内标的定量离子对分别为m/z 316.2→128.1和m/z 256.2→167.1。结果 线性范围为1～100 ng/mL(r=0.997 7)，最低定量限为1 ng/mL，日内和日间精密度(RSD)均<7.9%。结论 本方法简单、快速、灵敏、专属性高，适用于人尿液中戊乙奎醚药动学的研究。

戊乙奎醚；HPLC-MS/MS；尿液浓度；药动学

0 引言

盐酸戊乙奎醚(Penehyclidine hydrochloride，简称PH)是一种新型的抗胆碱药，对中枢神经有较强的抗M、N样作用，对外周神经有较强的抗M样作用和一定程度的抗N样作用。其选择性作用于M1、M3和N1、N2亚型受体，对M2亚型无明显作用。近年来主要应用于对抗有机磷中毒、麻醉前用药、胃肠平滑肌解痉、抑制膀胱收缩及减轻鼻粘膜水肿等[1]。国内已有文献报道测定血浆和动物尿液中戊乙奎醚浓度的方法[2-6]，但测定人尿液中戊乙奎醚浓度的文献很少[7]。鉴于此，本试验拟建立测定人尿液中戊乙奎醚浓度的HPLC-MS/MS方法，为临床合理用药提供参考。

1 仪器与试药

API3200型液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国AB公司)；LC-20AD液相色谱系统(日本岛津公司)；AB135-S型十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Thermo ST16R型冷冻离心机(美国热电)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；-80 ℃低温冰箱(中国海尔公司)。

盐酸戊乙奎醚对照品(成都力思特制药股份有限公司，批号：090701，纯度：99.9%)；盐酸苯海拉明对照品(Diphenhydramine hydrochloride，DH，中国药品生物制品检定所，批号：033k0106)；甲醇(色谱纯，Fisher)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式多重反应选择离子检测(MRM)，离子源喷雾电压为5 500 V，干燥温度为550 ℃，碰撞气压力为70 kPa，雾化气压力为44 kPa。用于定量分析的离子对分别为m/z 316.2→128.1(PH)，m/z 256.2→167.1(DH)。

2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP (4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：5 mM醋酸铵(甲酸调pH至5.5)-甲醇(35∶65，v/v)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.3 方法专属性 在“2.1”、“2.2”项色谱/质谱条件下，戊乙奎醚(A)及内标苯海拉明(B)的二级全扫描质谱图见图1。空白尿液、空白尿液中加入PH和DH，受试者尿液的典型色谱图见图2。由图2可见，PH的保留时间为2.14 min，DH保留时间为1.97 min，无内源性杂质干扰测定。

图1 PH(A)和DH(B)的二级全扫描质谱图

2.4 溶液的配制 对照品溶液：精密称取盐酸戊乙奎醚对照品13.88 mg(相当于戊乙奎醚12.5 mg)置25 mL容量瓶中，甲醇溶解后，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为500 μg/mL的PH储备液。取PH储备液，用纯水依次稀释成所需浓度的标准曲线工作液。内标溶液：精密称取盐酸苯海拉明对照品11.58 mg(相当于苯海拉明10.05 mg)，置100 mL容量瓶中，甲醇溶解后，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为100 μg/mL的DH储备液。取DH储备液，用纯水稀释成20 ng/mL的内标溶液，于4 ℃冰箱内保存备用。

图2 典型色谱图

2.5 受试者选择 健康受试者12例，男女各半，年龄21～24(23±1)岁，身高155～180(166±8)cm，体重指数19.05～23.31(21.22±1.45)kg/m2。所有受试者在试验前、后均进行常规体检、心电图和血液生化检查，受试者心、肝、肾功能未见异常。试验经成都军区总医院伦理委员会审批通过。全面健康体检合格后，受试者充分了解本试验的目的和要求，志愿受试，并签署知情同意书。

2.6 尿液样品处理 取冷冻尿液样品室温自然解冻，精密吸取尿液样品50 μL于2.0 mL塑料管中，加入内标溶液50 μL和纯水500 μL，涡旋混匀，10 000 r/min离心10 min(离心半径16 cm)，取上清液100 μL于进样瓶中，进行HPLC-MS/MS分析。

2.7 样品测定

2.7.1 标准曲线及定量下限 于8份50 μL空白尿液中分别加入系列浓度的标准曲线工作液，混匀，使PH尿液标准曲线浓度分别为1、2.5、5、10、20、40、80、100 ng/mL。其余按“2.5”项下方法处理，以PH峰面积与内标峰面积的比值(Y)与PH尿液浓度(X，ng/mL)进行加权线性回归，得回归方程：Y=0.035 5 X +0.008 2(r=0.997 7)。结果表明，PH浓度在1～100 ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为1 ng/mL。定量下限的精密度和准确度分别为：7.06%和110.49%(n=7)。

2.7.2 精密度试验 分别配制含PH的低、中、高(2.5、10、80 ng/mL)3个浓度的质控尿液样本，各7份，按“2.5”项下方法处理，根据当日标准曲线计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度，结果见表1。

表1 精密度试验结果(n=7)

2.7.3 基质效应[8]按“2.5”项下以纯水代替空白尿样处理3个低浓度质控(2.5 ng/mL)，进样后所得峰面积为A，再按“2.5”项下用6个不同来源的空白尿样各3个共18个处理低浓度质控(2.5 ng/mL)，进样后所得峰面积为B，按公式A/B×100%计算，分别得到PH和内标的基质效应因子MF1和MF2，按MF1/MF2计算内标归一化基质效应因子。所得6个内标归一化基质效应因子的变异系数为3.61%，符合欧盟指导原则[9]要求的小于±15%。

2.7.4 稳定性试验 分别配制含PH的低、中、高(2.5、10、80 ng/mL)3个浓度的质控尿液样本。按“2.5”项下方法处理，考察了尿液样本反复冻融3次稳定性，室温放置10 h稳定性，进样室放置(10 ℃)5 h稳定性，以及-80 ℃冷冻放置103 d稳定性。数据结果见表2。结果表明，在上述稳定性考察条件下，PH的浓度均保持稳定，未出现明显变化。

2.8 方法应用 健康受试者试验前禁食12 h，试验当日清晨空腹用200 mL温开水吞服0.6 mg盐酸戊乙奎醚片，分别于给药前及给药后0～2、2～4、4～8、8～12、12～24、24～36、36～48 h收集受试者的全部尿液，将各时间段的尿液混匀测量体积后，分别取1.5 mL于塑料管中，置-80 ℃低温保存待测。冷冻尿液样品按“2.5”项下方法处理并测定，12个受试者不同时间段测得的尿药累积排泄率-时间曲线见图3。

表2 稳定性实验结果(n=3)

图3 PH尿药累积排泄率-时间曲线(n=12)

3 讨论

盐酸戊乙奎醚为碱性药物，文献报道多在流动相中添加三乙胺[6]，试验中尝试了在流动相中添加扫尾剂三乙胺，但三乙胺使检测的灵敏度严重下降。经尝试不同浓度的醋酸铵盐溶液和酸碱度，综合考虑，确定流动相为5 mM醋酸铵(甲酸调pH 5.5)-甲醇(35∶65，v/v)，此条件下药物与内标的色谱峰峰形对称，相对分子离子峰强度高，有足够的灵敏度，能满足检测的要求。

已报道的测定小鼠及人尿液中戊乙奎醚浓度的样品前处理方法多为液液萃取[5-7]，本试验采用直接稀释后离心的方法处理样品，操作简单，能满足尿液样品的检测要求。本试验建立的测定人尿液中戊乙奎醚浓度的HPLC-MS/MS法专属性强，

准确度高，重现性好，操作简单，可快速准确地测定人尿液中戊乙奎醚的浓度。

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[2] 余琴,向瑾,梁茂植,等.HPLC-MS/MS法测定人血浆中戊乙奎醚及应用[J].中国新药杂志,2008,17(7):591-593.

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[6] 薛明,阮金秀,袁淑兰,等.LC-MS/MS及离子簇技术分析鉴定盐酸戊乙奎醚外消旋体在大鼠体内的代谢产物[J].药学学报,2002,37(10):802-806.

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[9] European Medicines Agency(EMEA),Committee for Medicinal Products for Human Use,Guideline on validation of bioanalytical methods[S].2009.

Determination of penehyclidine in human urine by HPLC-MS/MS

HUANG Juan1,2,YONG Xiao-lan1,2*，FENG Shi-yin2,WANG Lan-tian2,LI Nan2,DU Xiao-lin2

(1.School of Chemical Engineering,Sichun University,Chengdu 610065,China;2.Department of Clinical Pharmacy,Chengdu Military General Hospital,Chengdu 610083,China)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for determination of penehyclidine in human urine.Methods The supernatant liquid obtained from the diluted urine centrifugate was subjected to sample introduction and was analyzed by the HPLC-MS/MS method under flowing chromatographic conditions∶Agilent ZORBAX Bonus-RP column (4.6 mm×150 mm,5 μm),the mobile phase compositing with 5 mM ammonium acetate (pH was adjusted to 5.5 by formic acid):methanol (35∶65，v/v),with a rate of 1.0 mL/min,column temperature at 30 ℃,and injected sample volume of 10 μL.The results of positive ion MRM detection of penehyclidine and internal standards were m/z 316.2→128.1 and m/z 256.2→167.1.Results The calibration curve was linear over the concentration range of 1～100 ng/mL(r=0.997 7)with the lower limit of quantitation (LLOQ) 1 ng/mL.The intra-dayRSDand inter-dayRSDwere all below 7.9%.Conclusion The method is simple,rapid,specific and sensitive,it can be used for the pharmacokinetic study of penehyclidinein human urine.

Penehyclidine;HPLC-MS/MS;Urine concentration;Pharmacokinetics

2015-03-25

1.四川大学化学工程学院，成都 610065；2.中国人民解放军成都军区总医院临床药学科，成都 610083

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511022