雷公藤甲素对大鼠实验性结肠炎组织中IL-4、IL-13表达的影响

杨 立，肖明明，桑力轩，李 岩，邢 煜，王 岩，姚 远



雷公藤甲素对大鼠实验性结肠炎组织中IL-4、IL-13表达的影响

杨 立1*，肖明明1，桑力轩2，李 岩3，邢 煜1，王 岩1，姚 远1

目的 探讨雷公藤甲素对三硝基苯磺酸钠(TNBS)诱导的大鼠结肠炎的疗效，以及对炎性细胞因子IL-4、IL-13表达的影响。方法 成年SD大鼠18只,随机分为正常对照组(C组)、TNBS模型组(D1组)、雷公藤甲素组(TP组)。观察大鼠的一般情况，比较结肠组织炎症程度。HE染色观察大鼠结肠组织形态学变化。用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot(WB)法检测大鼠结肠组织IL-4和IL-13的表达水平。结果 PCR和WB法检测结果表明，C组结肠组织IL-4、IL-13的表达水平最高，D1组表达最低，TP组介于两者之间。结论 雷公藤甲素能有效治疗TNBS诱导的大鼠结肠炎,其作用机制可能与雷公藤甲素上调大鼠结肠黏膜抑炎因子IL-4、IL-13的表达，抑制炎症的发生发展有关。

实验性结肠炎;雷公藤甲素；IL-4；IL-13

0 引言

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性非特异性炎性肠病，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。以往的研究表明，其发病机制可能与遗传、感染、免疫异常等因素有关。其中免疫调节异常的作用日益引起人们的重视[1]。研究指出，IBD结肠黏膜聚集的淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和浆细胞等炎性细胞，可通过不同免疫途径损伤结肠黏膜的上皮组织，进而导致疾病发生。雷公藤甲素(Triptolide，TP)是从卫矛科雷公藤属植物根部分离出的二萜类化合物，鉴于其抗炎、免疫抑制等多种活性，临床上多用于关节炎、肾炎、皮肌炎等炎症性疾病的治疗。但用于炎症性肠病治疗的文献报道很少。本文采用三硝基苯磺酸(TNBS)诱导建立实验性大鼠结肠炎模型，检测大鼠结肠组织白细胞介素(IL)-4、IL-13表达的变化，探讨雷公藤甲素对大鼠实验性结肠炎IL-4、IL-13的调节作用及在UC治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备 雷公藤甲素，中国药品生物检定所产品。其他主要试剂和设备参看文献[2-3]。

1.2 实验对象、造模及实验分组

1.2.1 实验大鼠 8周左右SD雄性大鼠18只，SPF级，购于辽宁长生生物技术有限公司。许可证号：SCXK(辽)2010-0001。体重(200±20)g。所有大鼠实验前适应环境1周。

1.2.2 急性实验性结肠炎动物模型的建立 建立TNBS结肠炎模型[4]。18只大鼠随机分为3组，每组6只。分别为正常对照组(C组)、TNBS模型组(D1组)、雷公藤甲素组(TP组)。

造模前大鼠禁食24 h以排空大便，乙醚麻醉后进行TNBS造模。将25 mg TNBS溶解于0.25 mL的50%乙醇后，用直径2 mm的无菌聚乙烯管插入大肠内约8 cm处灌肠，保持肛门高位30 s。待清醒后正常喂养。造模完成第2天开始灌胃治疗。TP组：雷公藤甲素100 μg/(kg·d)与生理盐水制成混悬液，腹腔注射。模型组给予0.9%生理盐水灌胃，C组用50%乙醇溶液灌肠后，等体积(0.25 mL)生理盐水灌胃。连续7 d。

1.2.3 标本采集及处理 实验期间每日观察并记录大鼠精神、活动、毛发、粪便、体重。实验大鼠第8天水合氯醛腹腔内注射麻醉后处死，观察各组大鼠大肠的大体改变。用预冷生理盐水将大肠洗净，于结肠末端距离肛门1 cm处剪取0.5 cm结肠，用0.4%多聚甲醛浸泡、石蜡包埋、切片、HE染色做病理学分析。其余标本于-70 ℃冰箱保存备用。

1.3 结肠组织大体和组织学评估 参照Hamamoto等标准[5]计算疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分。结肠组织切片常规HE染色，参照Dieleman等[6]的方法，在光学显微镜下依据炎症程度病变深度、隐窝破坏情况、病变范围、进行结肠炎病理学(组织学损伤)评分。

1.4 组织IL-4、IL-13的RT-PCR检测 结肠黏膜组织总RNA提取按天根公司试剂盒说明书进行。将RNA样本进行逆转录得到对应的cDNA，在PCR仪上进行扩增。用引物设计软件进行引物设计。所有序列引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。IL-4上游引物CCTTGCTGTCACCCTGTTCTG，引物长度21 bp，退火温度60.4 ℃，产物长度181 bp；下游引物CTCGTTCTCCGTGGTGTTCCT，引物长度21 bp，退火温度61.4 ℃。IL-13上游引物长度20 bp，退火温度55.8 ℃，产物长度194 bp；下游引物GATATAAACTGGGCTACTTCG，引物长度21 bp，退火温度51.9 ℃。β-actin上游引物GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC，引物长度25 bp，退火温度60.1 ℃，产物长度155 bp；下游引物GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT，引物长度25 bp，退火温度62 ℃。在PCR管中加入如下反应体系：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master-mix 10 μL，用ddH2O补足至20 μL。根据设计PCR反应程序进行扩增，共30次循环，然后4 ℃ 5 min终止反应。PCR产物片段经1.5%的琼脂糖凝胶电泳。电泳后利用凝胶成像系统对得到的凝胶进行拍照，分析目的条带的灰度值。

1.5 结肠组织IL-4、IL-13 Western blot免疫印迹检测 主要操作参照试剂盒蛋白提取说明书进行。提取结肠黏膜总蛋白，SDS-PAGE蛋白质电泳，采用半干式电转，然后进行Western杂交。一抗：IL-4、IL-13，1∶1 000；二抗：IgG-HRP，1∶5 000稀释。内参抗体Mouse antiβ-actin-HRP 1∶10 000稀释。GEL-PRO凝胶成像系统成像，分析目的条带的灰度值。

2 结果

2.1 一般情况及肠组织损伤大体形态 D1组大鼠在TNBS灌肠后第2天出现精神萎靡、体毛凌乱、活动减少，肛周可见稀便沾染甚至血便，体重逐渐减轻，TP组大鼠未见肉眼血便，体重逐渐增加，症状明显轻于D1组。C组大鼠未见明显异常。C组结肠大体正常，大肠腺体规则，可见大量胞质富含黏液的杯状细胞，黏膜固有层、黏膜下层未见炎性细胞浸润。D1组肠组织可见肠壁坏死、变薄，肠黏膜可见溃疡，炎症程度较重，可见肠黏膜和黏膜下组织大量中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞浸润，杯状细胞胞质黏液分泌减少，肠黏膜隐窝变形，隐窝脓肿形成，黏膜下组织充血、水肿，伴急性小血管炎症、出血和纤维素样坏死。与D1组相比，TP组可见不同程度的炎症消散，表现为炎性细胞浸润减少、隐窝变形恢复和杯状细胞胞质黏液增多，溃疡缩小修复。

2.2 结肠组织炎性因子IL-4、IL-13的RT-PCR检测 RT-PCR结果表明，与C组比较，D1组大鼠结肠组织IL-4、IL-13相对表达水平明显下调，相对表达量由低到高依次为D1组、TP组、C组(见图1、图2)。统计学结果显示，D1组与TP组IL-4、IL-13的表达与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。TP组与D1组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；D1组IL-13的表达与C组比较差异有统计学意义(P<0.01)，TP组与C组和D1组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 大鼠结肠组织IL-4、IL-13的表达(RT-PCR检测)

图2 大鼠结肠组织中IL-4、IL-13的光密度值比较(RT-PCR法)

2.3 WB法检测结肠组织炎性因子IL-4、IL-13的表达 采用Western blot法检测各组大鼠结肠组织IL-4的表达，以β-actin为内参。C组大鼠结肠组织IL-4处于较高水平表达(IL-4/β-actin：0.72±0.06)；D1组大鼠结肠组织IL-4表达明显低于C组(IL-4/β-action：0.25±0.03，P<0.01)；TP组(IL-4/β-action:0.45±0.04)IL-4表达低于C组，高于D1组(P<0.05)。和IL-4表达类似，大鼠结肠组织IL-13在C组中也处于较高水平表达(IL-13/β-actin：0.97±0.06)；D1组IL-13表达明显低于C组(IL-13/β-actin：0.41±0.03，P<0.01)；TP组IL-13表达较C组明显减少(IL-13/β-actin：0.71±0.06，P<0.05)；TP组IL-13表达高于D1组，与D1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、图4。

图3 大鼠结肠组织IL-4、IL-13的表达(WB法)

图4 大鼠结肠组织中IL-4和IL-13的光密度值比较(WB法)

3 讨论

UC是肠道炎性疾病，肠道局部炎性损伤是其重要的病理改变，以大量的炎性细胞浸润肠壁和持续活化为主要特征。尽管其发病机制尚未明了，但在遗传、免疫、感染、环境等多种致病因素中，免疫机制是一个重要方面。有文献报道，T辅助细胞亚群多种炎性因子表达异常参与了UC的病理损伤过程，在黏膜免疫屏障中起重要的作用[7-8]。其中1型T辅助细胞(Th1)分泌的致炎因子可以调节肠上皮细胞表面受体与功能，导致细胞损伤。2型T辅助细胞(Th2)分泌的抑炎因子可以抑制Th1细胞的增殖与功能，同时抑制肠道炎症的发生。既往的研究指出，在炎症性肠病动物模型和患者的肠黏膜免疫反应中，Th1细胞致炎因子表达明显偏高[9-10]，而Th2细胞抑炎因子表达很少或不表达[11-13]。在上述这些炎性因子中，IL-4和IL-13在炎性细胞浸润及肠道炎症形成过程中起着重要作用。

IL-4由Th2细胞产生，是促进Th0细胞发育分化为Th2细胞的最主要因素，对淋巴细胞和巨噬细胞有免疫调节作用。研究发现，UC患者结肠黏膜IL-4表达明显降低；体外细胞培养实验亦发现，UC患者的IL-4分泌细胞数显著降低，且随着IL-4水平的降低，其抑制炎症反应的作用减弱，导致体内自身的免疫平衡遭到破坏，从而促使疾病发展[14-17]。

雷公藤甲素是雷公藤的主要有效成分之一，药理和临床试验表明，其具有免疫抑制、抗炎等生物活性。作为一种新型的免疫抑制剂，雷公藤甲素广泛用于多种疾病的治疗。研究表明，雷公藤甲素对小鼠淋巴细胞体外活化[18-19]和细胞免疫[20]均有抑制作用。对细胞因子IL-10缺陷小鼠腹腔注射雷公藤甲素，发现其能够降低术后肠内炎症发生，减轻术后肠粘结，显著降低了IFN-α的表达。Wu等[21]研究了雷公藤甲素免疫抑制作用的分子机制，认为雷公藤甲素可上调细胞中抑制蛋白的表达水平，导致胞内IB增多，而抑制NF-κB活性[22]。雷公藤甲素治疗TNBS诱导的小鼠结肠炎IL-17、RORC表达显著降低[23]。这是由于雷公藤甲素上调Foxp3，促进Treg细胞形成，抑制Th17细胞引起的过度炎症反应，进而减轻肠道炎症。Tam等[24]研究发现，雷公藤甲素和雷帕霉素联用可上调小鼠脾脏细胞中IL-4和IL-10的表达，下调IL-12和IFN-γ的表达，并能增加血清中IL-4的浓度。

本研究发现，D1组大鼠结肠组织中IL-4表达水平较C组显著降低；TP组IL-4的表达明显高于D1组。说明雷公藤甲素可上调抑炎细胞因子的分泌，提高IL-4表达活性。通过其明显的抗炎作用阻抑由T细胞、单核细胞等分泌的炎性分子，降低免疫细胞对炎症的反应性，从而有利于消除炎症、修复损伤。这一实验结果与其他中药制剂对UC小鼠肠组织IL-4表达影响的研究结果一致[25-26]。

IL-13是另一个与Th2细胞介导的肠黏膜炎症密切相关的细胞因子。作为Th2介导的UC中关键性的效应因子，IL-13与肠上皮细胞的紧密连接、细胞凋亡和修复密切相关[27]。Vainer等[28]研究发现，随着炎症细胞浸润程度的加强，IL-13的浓度逐渐降低，提示UC病变黏膜中IL-13的降低程度与其炎症程度呈平行关系。周宇等[29]亦发现，重度UC患者较轻度UC患者，活动期较之静止期，血浆IL-13浓度均明显降低。范震等[30]在中药复方溃结灵对UC模型大鼠血清IL-13表达影响的研究中指出，与对照组比较，TNBS模型组血清IL-13表达降低(P<0.01)；与TNBS模型组组比较，溃结灵组血清IL-13表达增高(P<0.05)。张涛等[31]研究了清肠栓对UC大鼠血清IL-1与IL-13的影响后指出，TNBS模型组血清IL-13含量低于正常组。而治疗7 d后，随着症状的改善，对照组及治疗组血清IL-13水平均呈上升趋势，与TNBS模型组比较差异有统计学意义。这进一步说明IL-13是具有抗炎作用的细胞因子，与组织损害程度呈负相关。有报道，中重度UC患者结肠组织IL-4和IL-13 mRNA的表达减少[15-17]。中重度UC患者血清中IL-4和IL-13的表达与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。本实验结果显示，在大鼠结肠炎组织中，IL-13在C组表达最高，D1组最低，而TP组中的表达介于两者之间。IL-13与IL-4表达相似，可能是因为IL-13与IL-4共用Ⅱ型受体，与IL-4在结构和功能上的相似性，是因为二者在氨基酸水平有部分同源性的缘故。

综上所述，抑炎性因子IL-4和IL-13与大鼠实验性结肠炎的发病关系密切，雷公藤甲素可以增大这两种抑炎因子的表达，减轻和改善结肠炎症状。但表达调控的具体过程等尚有待进一步研究。

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Effects of triptolide on the expression of intestinal mucosa IL-4 and IL-13 in experimental colitis rats

YANG Li1*,XIAO Ming-ming1,SANG Li-xuan2,LI Yan3,XING Yu1,WANG Yan1,YAO Yuan1

(1.Department of Gastroenterology，People′s Hospital of Liaoning Province，Shenyang 110016，China;2.Department of Geriatrics,The First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China;3.Department of Gastroenterology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To evaluate the curative effect of triptolide on TNBS induced colitis and the expression of intestinal mucosa IL-4 and IL-13 in experimental colitis rats and to investigate the underlying mechanisms.Methods 18 adult Sprague-Dawley rats were randomized into three groups:normal control group (group C),model group (group D1),tripotlide treatment group (group TP).The general status of the rats was observed,and the histopathologic changes in the colon were examined.Reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR) and Western blot (WB) techniques were used to detect the expression of IL-4 and IL-13.Results PCR and WB methods showed that the expression levels of IL-4 and IL-13 in group C were higher than those of group D1 and group TP(P<0.05),and the expression levels in group D1 were lover than those of group TP (P<0.05).Conclusion Triptolide could effectively improve the TNBS-induced colitis in rats by promoting the expression of IL-4 and IL-13 and inhibiting the development of inflammation.

Experimental colitis;Triptolide;Interleukin-4;Interleukin-13

2015-07-15

1.辽宁省人民医院消化内一科，沈阳 110016；2.中国医科大学附属第一医院老年消化科，沈阳 110001；3.中国医科大学附属盛京医院消化科，沈阳 110004

辽宁省自然科学基金课题(201102106)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511004

*通信作者