雷公藤甲素对MIA模型大鼠膝骨关节炎c-Jun、MMP-9表达及血清炎性标志物的影响

陈晓昱



雷公藤甲素对MIA模型大鼠膝骨关节炎c-Jun、MMP-9表达及血清炎性标志物的影响

陈晓昱

目的 观察雷公藤甲素对膝部骨关节炎滑膜c-Jun、MMP-9及血清PGE2、IL-8水平的影响，探讨其在膝部骨关节炎中的药理学价值。方法 45只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组及雷公藤甲素组，建立碘乙酸钠(Monosodium iodoacetate,MIA)膝关节炎模型，并给予雷公藤甲素干预，以Western blot及(qRT)-PCR法检测c-Jun及MMP-9在膝关节滑膜中蛋白及mRNA水平表达，以酶联免疫法检测外周血中PGE2及IL-8水平。结果 Western blot及(qRT)-PCR显示，c-Jun及MMP-9在膝关节滑膜组织中蛋白及mRNA水平上均有表达，雷公藤甲素组及正常对照组明显低于模型对照组(P<0.01)，雷公藤甲素组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；在血清PGE2及IL-8表达上，雷公藤甲素组及正常对照组明显低于模型对照组(P<0.05)。结论 雷公藤甲素可抑制骨关节炎滑膜中c-Jun及MMP-9表达，降低外周血PGE2及IL-8水平，抑制炎症反应，对骨关节炎有治疗作用。

骨关节炎；c-Jun；MMP-9；PGE2；IL-8；雷公藤甲素

0 引言

膝部骨关节炎发病呈现年轻化趋势，其病理改变以滑膜水肿、渗出、增生进而导致关节软骨炎性改变、损毁为特征，其发生及发展是多因素、多基因参与的过程[1]。AP-1(Activator protein 1)是一种转录因子，由c-Jun、c-Fos等组成，调节机体对生长因子、细胞因子、应激及细菌或病毒反应，c-Jun是AP-1复合体内的主要活性成分，对基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)分泌有调控作用[2]。MMPs是蛋白水解酶家族，MMP-9是MMPs中主要成员之一，对骨性关节炎的发生、发展及恶化有重要作用，并可诱发炎性标志物的释放，如PGE2、IL-8、TNF等[3]。雷公藤甲素是自雷公藤提取的活性成分，具有免疫抑制、抗炎和抗增殖作用，其在类风湿关节炎中的作用研究较多，在骨性关节炎中的药理作用还不明确[4]。本研究采用MIA方法建立大鼠膝部骨关节炎模型，给予雷公藤甲素干扰，检测c-Jun及MMP-9在滑膜中的表达，并检测血清炎性标志物PGE2及IL-8水平，目的在于观察雷公藤甲素在骨性关节炎中的作用，并探讨其机制及临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大鼠45只，由辽宁中医药大学动物试验室提供并饲养，体重(281.32±19.56)g。碘乙酸钠(MIA)购自美国Sigma公司，雷公藤甲素(TP)购自福建汉堂生物制药股份有限公司，PubChem号：24900156，纯度高于98%。TmiRNA isolation提取分离试剂盒、RPIM1640、LipofectamineTM2000及TRIzol购自美国Invitrogen公司，All-in-One(tm) tPCR Mix试剂盒购自南京凯基生物公司。c-Jun鼠源多克隆抗体、MMP-9山羊多克隆抗体、PGE2试剂盒、IL-8酶联免疫试剂盒均购自北京中杉金桥生物制品有限公司。引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。

1.2 研究方法

1.2.1 动物模型建立、干预及标本采集 45只SD大鼠随机分为正常对照组(C组)、模型对照组(M组)及雷公藤甲素组(T组)，每组15只。MIA模型大鼠制备方法参照文献方法[5]。M组及T组将0.3 mg MIA溶液注入大鼠左侧膝关节腔内，右侧膝关节注入0.3 mg生理盐水，C组两侧膝关节均注入0.3 mg生理盐水，均进行持续抽屉样膝关节运动。模型建立2周后进行干预。C组及M组给予正常饮食，无干预。T组依据Meeh-Rubner方法计算剂量，给予3 mg雷公藤甲素每天灌胃1次，连续14 d。所有大鼠无实验中脱落，实验第4周末采用颈椎脱臼法处死所有大鼠，观察膝关节大体标本，C组膝关节无肿胀，关节软骨外观为淡粉白色，光滑、明亮，具有光泽。M组左侧膝关节肿胀，关节软骨失去光泽，表面粗糙，色暗，有黄色渗出。T组左侧膝关节略肿胀，关节软骨光泽较暗，表面光滑，无渗出。

1.2.2 Western blot法检测c-Jun及MMP-9在膝关节滑膜组织中蛋白水平的表达 按说明书操作步骤提取各膝关节滑膜组织中总蛋白，BCA定量试剂盒进行蛋白浓度测定，样品均定量为6 g/L，每条泳道上样蛋白量为50 μg，经12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压70 V，电泳80 min，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入Ⅱ抗室温孵育1.5 h，TBST清洗，ECL发光后以凝胶显像仪显像。

1.2.3 qRT-PCR法检测c-Jun及MMP-9在膝关节滑膜组织中mRNA水平的表达 采用RNA分离试剂盒提取并纯化各膝关节滑膜组织中总RNA；RNA样本浓度稀释至1 g/L，按照逆转录及扩增试剂盒说明书操作步骤进行逆转录及扩增。c-Jun：正义序列5′-GACAUCCGATGCUCUGCCUT-3′，反义序列5′-UGCUGUAGTUCUGCCGCTG-3′；MMP-9：正义序列5′-CAGATGGTCCCGCCATCA-3′，反义序列5′-CCGCGCGTGACGAGUCAC-3′；GAPDH：正义序列5′-GATUCCGUCTGACCUTCAC-3′，反义序列5′-UCCGUGTGCGCACUTGTU-3′。RT反应体系如下：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，50×Syber Green 2 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。所有反应均设立复孔，以DEPC水代替模板，cDNA作为阴性对照。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，45个循环。

1.2.4 血清PGE2、IL-8浓度测定 所有SD大鼠均自球后静脉丛进行采血，依照酶联免疫法试剂盒说明书操作步骤测定血清中PGE2、IL-8浓度。

2 结果

2.1 Western blot法检测结果 Western blot显示，在39 kDa处有灰色条带显示，为c-Jun在膝关节滑膜组织中蛋白水平表达，M组中表达高于C组，差异有统计学意义(t=10.58，P<0.01)，T组表达低于M组，差异有统计学意义(t=3.42，P<0.05)，C组及T组差异无统计学意义(t=1.43，P>0.05)；在94 kDa处有灰色条带显示，为MMP-9在膝关节滑膜组织中蛋白水平表达，M组中表达高于C组，差异有统计学意义(t=11.23，P<0.01)，T组中表达低于M组，差异有统计学意义(t=4.27，P<0.05)，C组及T组差异无统计学意义(t=1.21,P>0.05)，见图1、图2。

图1 c-Jun、MMP在膝关节滑膜组织的蛋白表达

2.2 qRT-PCR检测结果 qRT-PCR显示，c-Jun在膝关节滑膜中mRNA水平有表达，M组表达高于C组，差异有统计学意义(t=9.27，P<0.01)，T组表达低于M组，差异有统计学意义(t=3.69，P<0.05)，C组及T组比较差异无统计学意义(t=1.93，P>0.05)；MMP-9在膝关节滑膜中mRNA水平有表达，M组表达高于C组，差异有统计学意义(t=10.96，P<0.01)，T组表达低于M组，差异有统计学意义(t=3.71，P<0.05)，C组及T组比较差异无统计学意义(t=1.82,P>0.05)，见图3。

图2 c-Jun及MMP-9在膝关节滑膜组织中蛋白水平表达

图3 c-Jun及MMP-9在膝关节滑膜组织中mRNA水平表达

2.3 PGE2、IL-8浓度检测 M组血清PGE2浓度高于C组，差异有统计学意义(t=8.54，P<0.01)；T组PGE2浓度低于M组，差异有统计学意义(t=2.91，P<0.05)；T组PGE2浓度与C组比较，差异无统计学意义(t=1.23，P>0.05)。M组血清IL-8浓度高于C组，差异有统计学意义(t=11.38，P<0.01)，T组IL-8浓度低于M组，差异有统计学意义(t=4.78，P<0.05)；T组IL-8浓度与正常对照组对比，差异无统计学意义(t=1.01，P>0.05)，见表1。

表1 三组血清PGE2、IL-8浓度比较

注：与M组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

本研究采用MIA方法构建大鼠膝部骨关节炎模型，大体标本显示，给予雷公藤甲素干预的膝关节炎性反应明显轻于无干预膝关节，表现为关节红肿及变形较轻，关节内渗出少，渗出液颜色清淡透明，无干预组渗出液淡黄色浑浊，雷公藤甲素干预组关节滑膜光泽及润滑程度均优于无干预组。Western blot及qRT-PCR显示，在蛋白水平及mRNA水平，膝关节炎滑膜组织中c-Jun及MMP-9在模型中的表达量明显高于正常膝关节及雷公藤甲素干预膝关节，而雷公藤甲素干预组中二者表达与正常组比较差异无统计学意义。表明雷公藤甲素可能通过抑制c-Jun表达，从而下调MMP-9表达，对膝关节炎的病理过程在基因水平进行调控。MMPs在细胞外基质中大量存在，可降解细胞外基质中的多种蛋白，MMP-9可诱发细胞外因子释放，在成纤维细胞增生中起到重要作用，并可导致炎性因子大量释放[6]。c-Jun形成以AP-1复合体的形式发挥活性，在转录水平对多种信号通路具有重要的调控作用。有研究表明，MMPs活性诱发及表达上调均受到AP-1的调控。雷公藤甲素对单核细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞的I-κB、NF-κB、c-Jun均有转录抑制作用，并可降低炎性反应因子的释放，进一步减轻对c-Jun上调诱因的刺激，降低其表达[7]。本研究显示，M组血清PGE2及IL-8浓度高于C组及T组，说明雷公藤甲素可降低外周血中炎性标志物的分泌。关节滑膜水肿、渗出是骨关节炎的初发阶段，雷公藤甲素可抑制T细胞中IL-2、IL-8、TNF分泌，MMP-9表达降低后，关节腔内及外周血炎性因子释放也会降低[8]。炎性因子是c-Jun及MMP-9表达上调的诱发因素之一，炎性因子释放减少，诱因随之减少，c-Jun及MMP-9表达也会降低。由于滑膜增厚是膝骨关节炎恶化加重的重要病理阶段，是骨关节炎进入不可逆转阶段的标志，经过滑膜增厚阶段，关节可能会出现损毁及功能丧失[9]。雷公藤甲素对细胞增殖具有明显的抑制作用，因此，滑膜组织在炎性因子及c-Jun的促增殖作用被抑制，是阻止关节损伤进入不可逆阶段的重要干预措施[10]。PGE2作为炎性因子，除了加重关节损伤外，还会诱发关节疼痛及全身炎症反应，雷公藤甲素对其分泌的抑制可能同时具有缓解骨性关节炎关节疼痛的作用。

本研究显示，在骨性关节炎滑膜中，c-Jun及MMP-9表达水平升高，外周血炎性标志物PGE2及IL-8升高，雷公藤甲素可抑制c-Jun及MMP-9表达，降低外周血PGE2及IL-8水平，抑制炎症反应，可作为骨性关节炎治疗药物进行进一步的药理学研究。

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Effect of triptolide on c-Jun,MMP-9 expression and serum inflammatory markers in rat MIA osteoarthritis model

CHEN Xiao-yu

(Department of Pharmacy,Shenyang Osteological Hospital，Shenyang 110044,China)

Objective To detect the effect of triptolide on c-Jun and MMP-9 in knee osteoarthritis synovium and serum PGE2and IL-8,discuss the pharmacological value of triptolide.Methods Forty-five SD rats were divided into normal control group,model control group and triptolide group randomly,MIA osteoarthritis models were constructed,and triptolide was given.The c-Jun and MMP-9 expression at protein and mRNA level in knee synovium were detected by Western blot and (qRT)-PCR.Results Western blot and (qRT)-PCR showed that c-Jun and MMP-9 were expressed at protein and mRNA levels in synovium tissues,the expression in triptolide group and normal control group was higher than those of model control group (P<0.01),there was no significant difference between triptolide group and normal control group (P>0.05).Serum PGE2and IL-8 in triptolide group and normal control group were lower than those of model control group (P<0.01),there was no significant difference between triptolide group and normal control group (P>0.05).Conclusion Triptolide can inhibit c-Jun and MMP-9 expression in osteoarthritis synovium,decrease the PGE2and IL-8 levels in peripheral blood,inhibit the inflammatory reaction,it has therapeutic effect on osteoarthritis.

Ostoearthritis；c-Jun；MMP-9；PGE2；IL-8；Triptolide

2015-03-12

沈阳市骨科医院药剂科，沈阳110044

10.14053/j.cnki.ppcr.201511006