响应面设计法优选金蝉花麦角甾醇提取工艺

杨安伦，陈 忠，李建生



响应面设计法优选金蝉花麦角甾醇提取工艺

杨安伦1*，陈 忠2，李建生3

目的 优选金蝉花中麦角甾醇的最佳提取工艺。方法 选择乙醇浓度、提取温度和提取时间为自变量，麦角甾醇提取量为因变量，在单因素试验基础上，采用星点设计-效应面法优选提取工艺，通过Design- Expert 8.0.6统计分析软件对试验数据进行多元线性模型和二次多项式模型拟合，并绘制效应面图和等高线图。结果 金蝉花中麦角甾醇的最佳提取工艺为以88%乙醇为提取溶剂，在74 ℃下提取38 min；麦角甾醇检测浓度在9.28～148.50 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率为97.99%。结论 优化的条件简单、快速，可为金蝉花的进一步开发利用和有效性研究提供理论依据。

金蝉花；麦角甾醇；提取工艺；HPLC；星点设计-效应面法

0 引言

金蝉花[1](Cordyceps cicadae)又名蝉花、蝉茸、虫花、蝉虫草、蝉茸菌，为麦角菌科真菌大蝉草(Cordyceps cicadae Shing)寄生于蝉科昆虫的若虫上形成的虫菌复合体，其性味甘寒，具散风热、定惊镇痉、明目之功效，属于虫草类药材。金蝉花含有丰富的生物活性成分，如多糖[2]、多种生物碱、D-甘露醇[3]、虫草酸、核苷类成分[4-5]、多种必需氨基酸[6]等有效成分。现代药理研究表明，金蝉花具有抗衰竭[7]、降血糖[8]、改善贫血、调解免疫功能[9]、耐缺氧、延长寿命、促进巨噬细胞吞噬能力等作用。

麦角甾醇是真菌类特征甾醇[10]，是一种重要的维生素D源。具有调节真菌细胞膜流动性的功能，确保细胞活力及物质运输[11]，同时在抗肿瘤方面也发挥重要的作用[12]。本试验采用星点设计-效应面法优选金蝉花麦角甾醇的提取工艺，以麦角甾醇提取量为响应值，使用Design-Expert 8.0.6软件分析，优化提取溶剂乙醇的浓度，提取时间和提取温度。并通过适用性考察，确定HPLC检测的最佳色谱条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪，配置包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、恒温柱温箱、DAD检测器，变色龙色谱数据工作站；Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱；梅特勒XS-105电子分析天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland)；KS-80中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；R-201恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)。

1.2 试药 金蝉花(批号：20140501，产地：浙江)购自浙江中医药大学中药饮片有限公司；麦角甾醇对照品(批号：111845-201102，含量97.7%)购自中国药品生物制品检定所；无水乙醇为分析纯，流动相甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

2 金蝉花麦角甾醇提取方法考察

2.1 提取溶剂的选择 称取金蝉花粉末(过三号筛)约0.25 g，精密加入溶剂、水及20%、40%、60%、80%乙醇溶液和无水乙醇各50 mL，在80 ℃水浴锅中提取45 min，冷却，过滤，取续滤液进行含量分析。如图1可知，溶剂对金蝉花麦角甾醇提取有较大影响，其中水、20%和40%乙醇溶液提取未检测出麦角甾醇成分，而80%乙醇对麦角甾醇提取有最佳效果。

图1 乙醇浓度对金蝉花麦角甾醇提取量的影响

2.2 提取温度的选择 称取金蝉花粉末约0.25 g，精密加入80%乙醇溶液50 mL，50、60、70、80、90、100 ℃水浴锅中提取45 min，冷却，过滤，取续滤液进行含量分析。如图2可知，80 ℃条件下金蝉花麦角甾醇提取效果最佳。

图2 提取温度对金蝉花麦角甾醇提取量的影响

2.3 提取时间的选择 称取金蝉花粉末约0.25 g，精密加入80%乙醇溶液50 mL，在80 ℃水浴锅中分别提取15、30、45、60、75、90 min，冷却，过滤，取续滤液进行含量分析。如图3可知，提取时间为30 min麦角甾醇提取效果最佳。

2.4 料液比的选择 称取金蝉花粉末约0.25 g，以料液比1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300 (g∶mL)精密加入相应体积的80%乙醇溶液，在80 ℃水浴锅中提取30 min，冷却，过滤，取续滤液进行含量分析。麦角甾醇含量依次为0.323、0.481、0.544、0.691、0.682、0.698 mg/g，由结果可知在料液比1∶200之后，随着料液比的增加，提取效果无明显改善，故实验以料液比1∶200进行提取。

图3 提取时间对金蝉花麦角甾醇提取量的影响

2.5 提取工艺的优化

2.5.1 星点试验设计与结果 在单因素试验基础上，选择乙醇浓度、提取温度和提取时间为考察因素进行星点试验设计，因料液比为非连续变量，确定料液比为1∶200 (g∶mL)，以麦角甾醇提取量为响应值，采用Design Expert 8.0.6 统计分析软件进行数据拟合，因素水平见表1，试验安排与结果见表2。

表1 金蝉花麦角甾醇提取工艺星点因素水平

表2 金蝉花麦角甾醇提取工艺星点试验安排

2.5.2 建立模型方程与显著性检验 应用Design-Expert 8.0.6 软件对表2中的数据进行二次多元拟合，得到乙醇浓度(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)与金蝉花麦角甾醇提取量之间的二次多项回归方程：Y=680.406+63.747 5 X1-3.298 75 X2+14.858 75 X3+1.265 X1X2+0.485 X1X3-16.442 5 X2X3-81.576 75 X12-10.059 25 X22-23.634 25 X32(R2=98.53%)。

从表3可以看出，因素中一次项提取时间对金蝉花麦角甾醇提取量具有显著性差异，乙醇浓度对金蝉花麦角甾醇提取量具有极显著差异，提取温度对金蝉花麦角甾醇提取量线性效应不显著；二次项中乙醇浓度对金蝉花麦角甾醇提取量的曲面效应极显著；比较各因子交互作用均不显著。

2.5.3 响应面分析 Design-Expert 8.0.6 软件依据回归方程来绘制响应面立体分析图及等高线，考察所拟合的响应面曲线的形状，并通过响应面等高线图(图4)和曲面图(图5)对影响金蝉花麦角甾醇提取量的条件中任何2种因素的交互效应进行评价和分析，从而确定最佳工艺。

表3 回归模型方差分析

图4 优化工艺模型的等高线叠加图

3.提取温度与提取时间对麦角甾醇提取量影响的等高线叠加图

图5 优化工艺模型的效应面图

3.提取温度与提取时间对麦角甾醇提取量影响的效应面图

2.5.4 工艺参数的优化及验证实验 由简化的回归方程进行预测分析，在星点设计试验条件范围内，最优试验条件为：乙醇浓度87.76%、提取温度74.44 ℃、料液比1∶200(g∶mL)、提取时间37.67 min，金蝉花麦角甾醇提取量的预测值为697.50 μg/g。

称取金蝉花粉末约0.25 g，共3份，分别精密加入88%乙醇溶液50 mL，在74 ℃水浴锅中提取38 min，冷却，过滤，取续滤液进行含量分析。得金蝉花麦角甾醇提取量分别为693.64、688.97、696.51 μg/g，平均值为693.04 μg/g，RSD=0.55%，与预测值接近，星点设计-响应面法优化的工艺合理可行。

3 麦角甾醇的HPLC测定

3.1 波长的选择 用UltiMate 3000 DAD对麦角甾醇在200～600 nm处进行扫描。麦角甾醇在283 nm处有最大吸收值，故选用283 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件 以Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃，紫外检测波长为283 nm，进样量为10 μL[13]。色谱图见图6。

图6 麦角甾醇标准品(1)及金蝉花样品(2)HPLC色谱图

3.3 对照品溶液的制备 精密称取麦角甾醇对照品3.8 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为储备液。根据要求，用甲醇将储备液稀释成9.28、18.56、37.13、74.25、148.50 μg/mL系列溶液，作为对照品溶液。

3.4 线性关系考察 按“3.2”项下色谱条件，依次吸取麦角甾醇系列对照品溶液各10 μL，注入色谱仪测定，以麦角甾醇吸收峰面积(Y)对质量浓度(X,μg/mL)进行线形回归，得回归方程：Y=0.149 7 X-0.190 4，R2=0.999 8，结果显示，进样量在9.28～148.50 μg/mL范围内有良好的线性关系。

3.5 精密度考察 以37.13 μg/mL麦角甾醇对照品溶液为测试溶液，对精密度进行考察。按“3.2”项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD为0.95%(n=6)，结果表明，此条件下麦角甾醇的精密度和重现性良好。

3.6 稳定性考察 称取金蝉花粉末约0.25 g，按“2.5.4”项下方法进行提取，过滤，取续滤液，分别在0、5、10、15、20、25、30 h进行测定，得峰面积，其RSD值为1.17%，结果表明，在30 h内样品稳定。

3.7 准确度考察 称取已知含量的金蝉花粉末6份，每份约0.25 g，加入适量麦角甾醇对照品，按“2.5.4”项下方法进行提取制备，金蝉花对照品溶液和供试品溶液各进样10 μL，测得峰面积并计算含量，得平均回收率为97.99%，RSD=0.69% (n=6)。

3.8 样品测定及重复性考察 精密称取同一批号金蝉花粉6份，每份约0.25 g，按“2.5.4”项下优化方法进行提取，测定峰面积，并计算麦角甾醇含量(μg/g)，平均值为700.25 μg/g，RSD为0.88%。

4 结论

4.1 提取方法的选择 本研究在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、提取时间和提取温度作为考察因素，麦角甾醇提取量为评价指标，以Design-Expert 8.0.6为分析软件，通过星点设计-效应面法对提取工艺进行优化。试验筛选出在1∶200 (g∶mL)料液比下，以88%乙醇溶液为提取溶剂，74 ℃水浴提取38 min，金蝉花麦角甾醇最高提取量为693.04 μg/g。

4.2 检测方法的确定 通过DAD扫描，麦角甾醇在283 nm处有最大吸收值，色谱条件以Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，甲醇为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温25 ℃，紫外检测波长为283 nm，进样量为10 μL。麦角甾醇在9.28～148.50 μg/mL范围内有良好的线性关系，且稳定性好、精密度高，适合对金蝉花麦角甾醇进行检测。

4.3 金蝉花的药用前景 虫草类真菌能产生多种生理活性物质，在生物技术及医疗保健上有重要的作用。经临床研究及药效学分析，金蝉花的活性成分种类、含量及功效并不亚于冬虫夏草，而相较于冬虫夏草，金蝉花价格相对低廉，生态要求比较低，故金蝉花潜在的医疗价值和经济价值非常巨大，市场前景非常广阔。

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Optimization of extraction technology of ergosterol in cordyceps cicadae by response surface methodology

YANG An-lun1*,CHEN Zhong2,LI Jian-sheng3

(1.Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China;2.Zhejiang Chinese Medical University Medical Pieces.,LTD,Hangzhou 311401,China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China)

Objective To optimize the extraction process of ergosterol in cordyceps cicadae.Methods Based on single factor tests,central composite design-response surface methodology was applied to optimize the process with ethanol concentration,extraction temperature and extraction time as independent variables,and the extraction amounts of ergosterol as dependent variable.Design-Expert 8.0.6 statistic analysis software was used to fit multivariate linear equation and second-order polynomial equation for experimental data,and delineate response surface and contour plot.Results The best technical condition was as follows:the extraction lasted for 38 min under 74 ℃ with 88% alcohol as the extration solvent.The linear range of ergosterol was 9.28～148.50 μg/mL and the average recovery rate was 97.99%.Conclusion The method is simple and rapid,and it provides scientific basis for the safety and effectiveness of cordyceps cicadae in clinical use.

Cordyceps cicadae;Ergosterol;Extraction technology;HPLC;Central composite design-response surface methodology

2015-03-04

1.浙江省中医院，杭州 310006；2.浙江中医药大学中药饮片有限公司，杭州 311401；3.浙江中医药大学，杭州 310053

浙江省中医药科学研究基金计划(2013ZA027)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511021

*通信作者