七氟烷预处理对失血性休克猪血浆肠脂肪酸结合蛋白、D-乳酸浓度和细菌移位的影响

王丽晶，孙莹杰，刁玉刚，张铁铮，金 强



·论著·

七氟烷预处理对失血性休克猪血浆肠脂肪酸结合蛋白、D-乳酸浓度和细菌移位的影响

王丽晶，孙莹杰，刁玉刚，张铁铮，金 强*

目的 探讨七氟烷预处理对失血性休克猪血浆肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、D-乳酸浓度和细菌移位的影响。方法 巴马小型猪24头，雌雄不拘，采用随机数字表法均分为对照(C)组、失血性休克(S)组和七氟烷预处理(Sev)组。Sev组吸入七氟烷并保持2%呼出浓度30 min，C组和S组吸入空气30 min。之后S组和Sev组制备失血性休克模型。分别于麻醉前(T0)、休克后30 min(T1)、1 h(T2)、1.5 h(T3)、2 h(T4)、3 h(T5)和4 h(T6)，应用ELISA法测定各组血浆D-乳酸和I-FABP含量。于T6时点取肠组织行HE染色，取下腔静脉血、肠系膜淋巴结及肝、肺、肾、脾组织行细菌培养，并计算远隔器官细菌移位率。结果 Sev组血浆D-乳酸、I-FABP浓度和远隔器官细菌移位率均明显低于S组(P<0.05)，明显高于C组(P<0.05)。HE染色显示，S组肠黏膜损伤严重，Sev较之明显减轻，C组肠黏膜结构正常。结论 七氟烷预处理可显著降低失血性休克猪血浆I-FABP、D-乳酸浓度和细菌移位，对肠黏膜屏障具有保护作用。

七氟烷；失血性休克；肠黏膜屏障；肠脂肪酸结合蛋白；D-乳酸；细菌移位

0 引言

失血性休克常引发心、脑、肾等重要器官功能障碍。最近研究表明，肠道不仅是失血性休克易损器官之一，肠黏膜缺血再灌注损伤引发的细菌移位更是休克病理生理发展过程中的重要不利因素[1]。目前，国内外针对失血性休克后的肠道损伤主要采取对症治疗，但效果并不理想。而越来越多的研究显示，围手术期广泛应用的七氟烷，不仅是高效的吸入性全身麻醉药，更具有减轻心、肺、肝等重要器官缺血再灌注损伤的作用[2-4]。本研究以失血性休克猪为研究对象，观察七氟烷预处理对其肠黏膜屏障功能损伤特异性指标I-FABP、D-乳酸和细菌移位的影响，探讨七氟烷的肠黏膜屏障保护作用，为失血性休克时肠道缺血缺氧损伤的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年巴马小型猪24头(沈阳军区总医院医学实验动物科提供)，雌雄不拘，体重22～25 kg，采用随机数字表法均分为对照(C)组、失血性休克(S)组和七氟烷预处理(Sev)组，每组8头。

1.2 模型制备及分组处理 麻醉前实验动物禁食水8 h。各组动物经耳缘静脉注射丙泊酚3 mg/kg麻醉后，经口气管插管(ID 7.5 mm)，行机械通气(芬兰Ohmeda公司，Ohmeda 9300型)，呼吸频率25次/min，潮气量7 mL/kg，吸入氧浓度100%。四肢接心电图导联，连接多功能监护仪(美国GE公司，Datex-Ohmeda S/5型)，并置直肠温度探头行体温监测。手术部位碘伏消毒，1%利多卡因局部麻醉下行双侧股动脉和右颈内静脉剖开置管。左侧股动脉导管经压力换能器连接监护仪，连续监测动脉血压。Sev组吸入七氟烷并保持2%呼出浓度30 min，C组和S组吸入空气30 min。之后，S组和Sev组在15 min内经右侧股动脉匀速放血30 mL/kg(相当于40%的总血容量)，制备容量控制性失血性休克模型[5]，C组不放血处理。

1.3 标本采集和测定 分别于麻醉前(T0)、休克后30 min(T1)、1 h(T2)、1.5 h(T3)、2 h(T4)、3 h(T5)和4 h(T6)，经右颈内静脉采血3 mL，4 ℃下3 000 g离心10 min后，取上清液-80 ℃保存。采用ELISA法测定血浆I-FABP和D-乳酸含量(ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司)。休克4 h后放血处死动物，取空肠组织行HE组织病理学染色。无菌条件下取下腔静脉血100 μL，接种于固体培养基。取肠系膜淋巴结、肝、肺、肾、脾组织称重后，放入盛有l mL生理盐水的无菌研磨管中研成悬液，取20 μL接种于固体培养基，培养24 h后鉴定有无细菌生长及细菌种类，并计算远隔器官细菌移位率，细菌移位率(%)=细菌移位阳性脏器个数/脏器总数×100%。

2 结果

2.1 血浆I-FABP和D-乳酸含量的变化 与T0时点比较，S组和Sev组血浆I-FABP浓度在T1～T6时点均显著增高(P<0.05)，且S组在T3时点达到峰值，Sev组在T4时点达到峰值，然后呈下降趋势。组间比较，Sev组血浆I-FABP浓度在T1～T6时点均高于C组(P<0.05)，且低于S组(P<0.05)。与T0时点比较，S组和Sev组血浆D-乳酸浓度在T2～T6时点均显著增高(P<0.05)，Sev组高于C组(P<0.05)，且低于S组(P<0.05)。见表1。

表1 三组各时点血浆I-FABP和D-乳酸浓度的变化(n=8)

注：与T0时比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与S组比较，#P<0.05

2.2 肠道细菌移位率检测结果 三组从血、肠系膜淋巴结、肝、肾、肺、脾组织中共检出大肠杆菌、肠球菌两种细菌，均属肠道常驻菌，见图1。经计算，Sev组远隔器官细菌移位率低于S组(P<0.05)，高于C组(P<0.05)。见表2。

2.3 组织病理学观察结果 HE染色显示，C组肠黏膜结构正常，腺体绒毛刷状缘整齐，黏膜无水肿充血。S组肠黏膜损伤严重，可见黏膜出血、大量上皮细胞坏死和炎细胞浸润。Sev组较S组损伤明显减轻，仅见轻度腺体扩张、上皮下间隙水肿和少量炎细胞浸润。见图2。

图1 光镜下检出的远隔脏器细菌种类

组别动物数(只)检测脏器数(个)肠道细菌移位脏器数(个)血肠系膜淋巴结肝肺肾脾合计细菌移位率(%)C组84803100048．33S组8482887733572．92∗Sev组8480855202041．67∗#

注：与C组比较，*P<0.05；与S比较，#P<0.05

图2 各组空肠组织病理学染色结果(HE，×10)

3 讨论

急性失血是围手术期低血容量休克的常见原因。其引发的循环血容量不足和红细胞比容骤降，可导致心排血量减少、周围血管收缩和血压下降，进而促发器官氧供需失衡、组织无氧代谢和功能受损。既往针对失血性休克器官保护的研究，主要集中在心、脑等重要脏器。而新进研究显示，机体为保障休克时心脑等重要器官的供血，肠循环常发生血液重新分布而更易出现低灌注。由于肠绒毛具有“逆流交换机制”等特点，使肠黏膜对缺血缺氧极为敏感而更易引发肠屏障受损[1]，进而导致肠道菌群大量移位至其他器官而加重休克。因此，肠黏膜屏障既是休克病理过程的“易受害者”，更是加剧休克的“发起者”。目前，临床上针对休克引发的肠黏膜屏障损伤主要采用对症治疗，但疗效不佳。而应用基于药物的器官保护策略，可能针对病理损伤机制而发挥良好的防治作用。

七氟烷是临床上常用的吸入麻醉药。研究表明，其对心、脑、肝、肾等器官具有保护作用[2-4]。Rodriguez-lopez等[6]研究显示，七氟烷可明显减少猪主动脉手术过程中低血压和酸中毒的发生。而Stumpner等[7]的研究证实，七氟烷通过COX-2介导而减少心肌梗死的面积。由于失血性休克和心脏手术过程中的体外循环有相似的病理生理过程，本研究选用七氟烷，以观察其对失血性休克肠黏膜屏障的保护作用。过高浓度的七氟烷吸入可能产生心肌抑制和血压下降而加重休克，且围手术期失血性休克常发生于全麻30 min以后的手术过程中，因此本研究选用预先吸入2%(1 MAC)七氟烷30 min的预处理方式。组织病理学染色结果显示，失血性休克4 h后S组肠黏膜屏障显著受损，Sev组较其明显减轻。表明七氟烷预处理可明显改善失血性休克引发的肠黏膜屏障破坏。

I-FABP是哺乳动物肠道黏膜微绒毛组织内独有的低分子蛋白质，因其在肠黏膜缺血、缺氧早期即可大量释放入血，所以近年来被认为是诊断肠损伤的早期敏感指标[8]。有研究显示，手术结束时，高浓度血清IFABP对诊断肠坏死的敏感性为100%、特异性为98.1%[9]。本研究中，S组血浆I-FABP浓度在失血性休克后30 min即开始增加，1.5 h达峰值，并持续至4 h以上。Sev组血浆I-FABP浓度不仅显著低于S组，且血浆峰值延后至休克后2 h，表明七氟烷预处理不仅减轻、而且延缓了失血性休克肠黏膜屏障破坏的发展。

哺乳动物体内D-乳酸主要由肠道内菌群发酵生成，因此，肠屏障破坏时，其血浆浓度迅速上升。Sobhian等[10-11]研究显示，D-乳酸是预测失血性休克肠道损伤和预后的重要指标。本研究中，S组血浆D-乳酸浓度在失血性休克后1 h开始增高，晚于I-FABP的升高时间，表明在预测肠屏障损伤方面，D-乳酸指标稍滞后于I-FABP。由于Sev组在休克后4 h血浆D-乳酸浓度较休克后1 h升高，虽明显低于S组，但仍高于C组，表明七氟烷预处理并未完全阻止失血性休克引发的肠黏膜屏障破坏，或者由于肠道内菌群移位至全身而上调了D-乳酸浓度。

失血性休克发生后，肠黏膜屏障的严重受损可导致肠道正常菌群或内毒素向肠外转移而加重休克。因此，保护肠黏膜屏障功能，减少细菌与毒素移位，是低血容量休克治疗的重点[12]。研究表明，机体免疫功能受抑、肠黏膜免疫屏障受损，是细菌移位的重要条件和主要原因[13]。现已发现，临床上常用的吸入麻醉药均可抑制单核和巨噬细胞释放细胞因子而发挥抗炎作用[14]。亦有研究表明，七氟烷预处理可以通过抑制炎症反应而降低感染性休克大鼠的死亡率[15]。本研究中，S组血液、肝、肾等脏器中检出2种肠道菌群，Sev组细菌移位率明显低于S组，表明七氟烷预处理可明显降低失血性休克引发的肠道细菌移位，提示七氟烷可能通过减轻失血性休克引发的炎性反应而改善肠屏障功能。

本研究中，Sev组血浆I-FABP、D-乳酸浓度和细菌移位虽明显低于S组，但仍明显高于C组，说明2%七氟烷30 min预处理，能减轻但不能完全阻止失血性休克猪肠黏膜屏障损伤的发生。增加七氟烷吸入浓度和吸入时间、七氟烷预处理是否可以完全阻止失血性休克引发的肠黏膜屏障损伤，需要进一步研究证实。

综上所述，七氟烷预处理可显著降低失血性休克猪血浆I-FABP、D-乳酸浓度和细菌移位，对肠黏膜屏障具有保护作用。

[1] Brandt LJ,Boley SJ.AGA technical review on intestinal ischemia[J].Gastroenterology,2000,118(5):954-968.

[2] Warltier DC,Al-Wathiqui MH,Kampine JP,et al.Recovery of contractile function of stunned myocardium in chronically instrumented dogs is enhanced by halothane or isoflurane[J].Anesthesiology,1988,69(4):552-565.

[3] Kalimeris K,Zerva A,Matsota P,et al.Pre-treatment with sevoflurane attenuates direct lung injury[J].Minerva Anestesiol,2014,80(6):635-644.

[4] Bedirli N,Ofluoglu E,Kerem M,et al.Hepatic energy metabolism and the differential protective effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia in a rat hepatic ischemia-reperfusion injury model[J].Anesthesia & Analgesia,2008,106(3):830-837.

[5] Wu X,Kochanek PM,Cochran K,et al.Mild hypothermia improves survival after prolonged,traumatic hemorrhagic shock in pigs[J].AJ Trauma,2005,59(2):291-299.

[6] Rodriguez-Lopez JM,Sanchez-Conde P,Lozano FS,et al.Laboratory investigation:effects of propofol on the systemic inflammatory response during aortic surgery[J].Canadian Journal of Anesthesia,2006,53(7):701-710.

[7] Stumpner J,Tischer-Zeitz T,Frank A,et al.The role of cyclooxygenase-1 and-2 in sevoflurane-induced postconditioning against myocardial infarction[J].Semin Cardiothorac Vasc Anesth,2014,18(3):272-280.

[8] Adriaanse MP,Tack GJ,Passos VL,et al.Serum I-FABP as marker for enterocyte damage in coeliac disease and its relation to villous atrophy and circulating autoantibodies[J].Alimentary Pharmacology & Therapeutics,2013,37(4):482-490.

[9] Windsant IC,Hellenthal FA,Derikx JP,et al.Circulating intestinal fatty acid-binding protein as an early marker of intestinal necrosis after aortic surgery:a prospective observational cohort study[J].Annals of Surgery,2012,255(4):796-803.

[10]Evennett NJ,Petrov MS,Mittal A,et al.Systematic review and pooled estimates for the diagnostic accuracy of serological markers for intestinal ischemia[J].World Journal of Surgery,2009,33(7):1374-1383.

[11]Sobhian B,Kröpfl A,Hölzenbein T,et al.Increased circulating D-lactate levels predict risk of mortality after hemorrhage and surgical trauma in baboons[J].Shock,2012,37(5):473-477.

[12]曹国龙,程爱国,张小平.失血性休克中肠屏障的损伤[J].华北煤炭医学院学报,2006,8(2):168-170.

[13]Brenchley JM,Douek DC.Microbial translocation across the GI tract[J].Annu Rev Immunol,2012,30(1):149-173.

[14]Hofstetter C,Flondor M,Boost KA,et al.A brief exposure to isoflurane (50 s) significantly impacts on plasma cytokine levels in endotoxemic rats[J].International Immunopharmacology,2005,5(10):1519-1522.

[15]Hiltebrand LB,Koepfli E,Kimberger O,et al.Hypotension during fluid-restricted abdominal surgery:effects of norepinephrine treatment on regional and microcirculatory blood flow in the intestinal tract[J].Anesthesiology,2011,114(3):557-564.

Effect of sevoflurane preconditioning on the concentration of plasma I-FABP and D-lactate and bacterial translocation in hemorrhagic shock pigs

WANG Li-jing,SUN Ying-jie,DIAO Yu-gang,ZHANG Tie-zheng,JIN Qiang*

(Department of Anesthesiology,The General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China)

Objective To investigate the effect of sevoflurane preconditioning on the concentration of plasma I-FABP and D-lactate and bacterial translocation in hemorrhagic shock pigs.Methods Twenty four Bama miniature pigs with male and female informal were equally divided into control (C) group,hemorrhagic shock (S) group and sevoflurane precondition (Sev) group using random number table method.Pigs from group Sev inhaled 2% sevoflurane 30 min while animals from group C and group S inhaled air.Afterwards, the hemorrhagic shock model was established in group S and group Sev.The concentration of plasma I-FABP and D-lactate were measured using ELISA method before anesthesia (T0) and at 30 min (T1),1 h (T2),1.5 h (T3),2 h (T4),3 h (T5),4 h (T6) after the hemorrhagic shock model was made.The jejunum sample was obtained for HE staining at T6,and the inferior vena venous blood,mesenteric lymph nodes,live,lung,kidney and spleen samples were obtained for bacterial culture at the same time.Afterwards,the bacterial translocation rate was calculated.Results The concentration of plasma D-lactate,I-FABP and the rate of bacterial translocation in group Sev were lower than those of group S (P<0.05) and higher than those of group C (P<0.05).HE staining showed obvious intestinal mucosa injury in group S.The injury was alleviated in group Sev while the tissue structure in group C was normal.Conclusion Sevoflurane preconditioning can significantly decrease the concentration of plasma I-FABP,D-lactate and bacterial translocation,and has gut mucosal barrier protection effect on hemorrhagic shock pigs.

Sevoflurane;Hemorrhagic shock;Gut mucosal barrier;I-FABP;D-lactate;Bacterial translocation

2015-04-18

沈阳军区总医院麻醉科，沈阳 110016

军队后勤科研重点项目(BWS12J008)；国家自然科学基金(81471121)

10.14053/j.cnki.ppcr.201511001

*通信作者