MTX联合复方风湿宁对RA滑膜成纤维细胞IL-22的影响

作者单位:541000 广西 桂林,桂林医学院研究生学院

李晓佳



MTX联合复方风湿宁对RA滑膜成纤维细胞IL-22的影响

作者单位:541000 广西 桂林,桂林医学院研究生学院

李晓佳

[摘要]目的观察甲氨蝶呤(MTX)和风湿宁对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞IL-22水平的影响,为其治疗机制的研究提供新靶点。方法分离、纯化、培养类风湿性关节炎患者滑膜组织成纤维样滑膜细胞,并分别加入MTX(MTX组)、复方风湿宁(复方风湿宁组)、MTX联合复方风湿宁(联合组)进行共培养,MTT法检测MTX和复方风湿宁对滑膜成纤维细胞增殖的影响；用RT-PCR方法检测各组滑膜成纤维细胞IL-22及凋亡相关基因caspase-3和caspase-9 的mRNA表达。结果联合组的细胞增殖抑制率和caspase-3、caspase-9 mRNA表达水平明显高于其他两组(P<0.05),IL-22 mRNA表达水平明显低于其他两组(P<0.05),但MTX组和复方风湿宁组之间各项指标无显著差异(P>0.05)。结论MTX和复方风湿宁均可降低类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞IL-22水平,抑制细胞增殖反应,且联合应用可发挥协同效果,增强疗效。

[关键词]MTX；风湿宁；类风湿性关节炎；滑膜；成纤维细胞；IL-22

Effect of MTX with compound Fengshining on synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with RA

Li XiaojiaGraduate School of Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, 541000, China

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of methotrexate (MTX) and compound Fengshining (FSN) on synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with rheumatoid arthritis (RA) in order to provide new targets for the research on the therapeutic mechanism.MethodsSynovial membrane fibroblasts of the patients with RA were obtained after separation, purification, and cultivation; and then, MTX (MTX group), compound FSN (compound FSN group), and MTX with compound FSN (combination group) were added respectively for further cultivation. MTT method was used to determine the effect of MTX and compound FSN on the proliferation of synovial membrane fibroblasts, RT-PCR method was used to determine the expression level of IL-22 and that of apoptosis-related caspase-3 and caspase-9 mRNA in every group.ResultsThe inhibitory rate of cell proliferation and expression levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in the combination group were significantly higher than those in the other two groups (P<0.05), and the expression level of IL-22 mRNA was significantly lower than that in the other two groups (P<0.05), but there was no significant difference in other indexes between the other two groups (P>0.05).ConclusionBoth MTX and compound FSN can reduce the level of synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with RA and inhibit the cell proliferation reaction, and combination application of them can obtain a synergistic effect and enhance the efficacy.

[Key words]MTX; Fengshining; rheumatoid arthritis; synovial membrane; fibroblast; IL-22

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)直接侵犯滑膜关节,多数患者发病时成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)存在病理性增生[1]。IL-22主要由Th22细胞分泌,在炎症免疫性疾病的发病机制中介导重要环节。国内外研究已证实RAFLS细胞中存在IL-22的高表达,且其表达程度与患者的疾病严重程度密切相关[2-3]。甲氨蝶呤(MTX)是传统抗风湿药之一,也是目前临床治疗RA的基本用药。复方风湿宁是针对RA发病特征而研制的纯中药制剂,由两面针、七叶莲、宽筋藤等六味中药组成,具有祛风止痛、活血化瘀、舒筋活络等多重作用。本研究分析MTX和复方风湿宁对RAFLS细胞增殖及IL-22的影响,以为其联合用药提供理论支撑。

1材料与方法

1.1标本来源人关节滑膜组织取自本院收治并行膝关节置换术的RA患者,采集后保存于无菌含双抗Hanks液中,并于30 min之内转移至实验室进行细胞培养。RA诊断按照美国风湿协会1987 版标准。

1.2主要仪器和试剂低温高速离心机(TGL20M,麦尚仪器)；酶标分析仪(318C,上海精科)；梯度 PCR 扩增仪(TP600,TAKARA)；凝胶成像分析仪(FR-980,上海复日)；电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-III2)；MTX片(上海信谊药厂有限公司)；复方风湿宁片(广东罗浮山国药股份有限公司)；caspase-3、caspase-9及IL-22引物由上海生工设计并提供,详细序列如表1所示。

1.3实验步骤

1.3.1细胞培养采集滑膜组织后,仔细剔除连带血管、脂肪及软组织,以PBS液冲洗3~5次。将干净的滑膜组织剪碎,以糊状为宜,1000 r/min离心5 min,弃上清,先后用4 mg/ml的Ⅰ型胶原蛋白酶和0.25%的胰蛋白酶消化120 min(37 ℃、5% CO2恒温孵育)。当组织被消化为细胞或细胞团时,终止消化,悬浮于含青、链霉素(100 U/ml)及10%胎牛血清的DMEM培养液,37 ℃、5%CO2恒温孵育。每隔72 h更换1次培养液,显微镜下观察细胞生长情况。当原代细胞长满瓶底、细胞长满瓶壁的80%~90%时,以胰酶消化进行传代培养。并留取第3~4代稳定细胞用于实验。

表1　caspase-3、caspase-9及IL-22 的引物序列

1.3.2滑膜细胞增殖实验取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×105/ml,接种于96孔板,每孔100 μl,各取24孔作为对照组、MTX组、复方风湿宁组和联合组。MTX组加入0.1 g/L的MTX,复方风湿宁组加入0.1 g/L的复方风湿宁,联合组同时加入两种药物各0.1 g/L,空白组为纯培养基。继续培养48 h,各组取6个样品孔进行细胞增殖实验,每孔加入20 μl MTX(5 mg/ml),继续培养4 h,吸弃培养基,加入二甲基亚砜,每孔150 μl,振荡摇匀,酶标仪测定吸光度(570 nm),计算细胞增殖抑制率(IR):IR=[1-A(给药)/A(对照)]×100%。

1.3.3RT-PCR测定caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表达取加入药液培养48 h的细胞,加入细胞裂解液 Trizol,常规提取总RNA,并以核酸蛋白仪检测其浓度。3项指标均从各组取6个样品孔进行测定,取其平均值作为最终测定结果。常规反转录合成cDNA,收集cDNA样品进行 PCR 扩增。扩增所得产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳,紫外线识别条带,经凝胶成像分析软件分析相对光密度,即“目的条带光密度/ GAPDH条带光密度”,以此作为目的基因的mRNA表达量。

2结果

2.1细胞增殖抑制率联合组细胞增殖抑制率为(31.3±4.83)%,MTX组为(22.4±4.05)%,复方风湿宁组为(21.6±4.12)%,各组细胞增殖抑制率有统计学差异(F=6.728,P<0.05),其中联合组最高,MTX组和复方风湿宁组之间无显著差异(P>0.05)。

2.2caspase-3、caspase-9和IL-22 mRNA表达水平各组患者的caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表达水平均有统计学差异(P<0.01)；其中caspase-3、caspase-9 mRNA表达水平以联合组为最高,对照组为最低,MTX组和风湿宁组之间无显著差异(P>0.05)；IL-22 mRNA表达水平以联合组为最低,对照组最高,MTX组和复方风湿宁组之间无显著差异(P>0.05),见表2、图1。

表2　各组caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表达水平比较(n=6)

注:与对照组相比,①P<0.01；与联合组相比,②P<0.01

图1　各组caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA的RT-PCR凝胶电泳

3讨论

FLS过度增生和局部炎性反应是RA的两大临床病理特征,研究表明,RA发病过程中,FLS可由正常水平的1~3层细胞增至15 层以上；且增生的FLS具有类似肿瘤细胞的高侵袭性,凋亡反应受到抑制,持续分泌大量基质金属蛋白酶,破坏软骨组织[4]。caspase家族是介导细胞凋亡过程的关键环节,其中caspase-9主要介导凋亡反应的初始阶段,而caspase-3主要介导凋亡反应的凋亡阶段,故caspase-9和caspase-3可用以衡量凋亡反应的整体活化状态[5-6]。在RA发病过程中,除自身增生和破坏骨质之外,FLS细胞还可分泌多种炎性介质及趋化因子,募集免疫细胞及炎性细胞,促进关节免疫炎性反应。IL-22是IL-10细胞因子家族成员,为Th22细胞的主要效应因子,高表达于角质形成细胞和成纤维样细胞。体外研究表明,Th22细胞诱导可成百倍地上调抗病原微生物趋化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11的表达,对于具有抗菌、抗病毒作用的CCL2、CCL5及CCR6亦有显著促进作用,且该过程伴随着IL-22的大量产生[7-8]。说明在免疫炎性反应的激活中,IL-22发挥了举足轻重的作用。

经临床证实,MTX和复方风湿宁均为治疗RA的有效药物[9-10],但其药理机制尚未完全明确。本研究重点探讨MTX和复方风湿宁对RA滑膜成纤维细胞IL-22水平的影响。姚瑶等[11]研究表明,teriflunomide联合MTX可以有效抑制 RAFLS增殖,防止骨质破坏。本研究结果显示,单纯的MTX对RAFLS 增殖亦有抑制作用,但与复方风湿宁联合应用时,其抑制效能可得到显著提高,说明二者有协同作用。进一步的研究结果显示,MTX和复方风湿宁均可提高RAFLS caspase-3、caspase-9 mRNA表达水平,说明激活凋亡通路,加速RAFLS凋亡进程,可能为两者发挥抑制细胞增殖作用的重要机制。另外,本研究发现,MTX和复方风湿宁均能降低RAFLS IL-22 mRNA表达水平,且联合应用时效果最佳。已有研究证实[12],IL-22 mRNA在RA患者的滑膜组织及滑膜单核细胞中的表达均有明显上调。与此同时,上调的IL-22可促进纤维细胞膜表面的RANKL高表达,加速破骨细胞生成。故IL-22可作为RA早期骨侵蚀的血清学标志,预测发病程度。本研究结果说明,MTX和复方风湿宁均可抑制RAFLS和炎性因子IL-22的产生,但联合应用效果更佳。

综上所述,RA患者的FLS凋亡反应受到抑制,增生活动亢进,同时伴随IL-22的分泌和激活。MTX和复方风湿宁均可上调细胞凋亡因子caspase-3、caspase-9的mRNA表达,从而促进凋亡,抑制RAFLS过度增生和IL-22过表达所导致的免疫炎性损伤,而两药联合应用效果更佳。

【参考文献】

[1]Scott D,Wolfe F,Huizinga T.Rheumatoid arthritis[J].Lancet,2010,376(9746):1094-1108.

[2]Carrión M,Juarranz Y,Gomariz R,et al.VIP modulates IL-22R1 expression and prevents the contribution of rheumatoid synovial fibroblasts to IL-22-mediated joint destruction[J].Journal of Molecular Neuroscience,2014,52(1):10-17.

[3]于乐,顾美华.Th22细胞与类风湿性关节炎的关系[J].现代免疫学,2013,33(1):81-83.

[4]Dharmapatni A,Smith M,Haynes D,et al.Elevated expression of caspase-3 inhibitors,survivin and xIAP correlates with low levels of apoptosis in active rheumatoid synovium[J].Arthritis Research & Therapy,2009,11(1):13.

[5]Li R,Cai L,Xie X,et al.7,3'-dimethoxy hesperetin induces apoptosis of fibroblast-like synoviocytes in rats with adjuvant arthritis through caspase 3 activation[J].Phytotherapy Research,2010,24(12):1850-1856.

[6]Bertolotto M,Dallegri F,Montecucco F,et al.Sulphasalazine accele-rates apoptosis in neutrophils exposed to immune complex:role of caspase pathway[J].Clinical And Experimental Pharmacology & Physiology,2009,36(11):1132-1135.

[7]Carrión M,Juarranz Y,Gomariz R,et al.IL-22/IL-22R1 axis and S100A8/A9 alarmins in human osteoarthritic and rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J].Rheumatology(Oxford,England),2013,52(12):2177-2186.

[8]Zhao L,Jiang Z,Wang K,et al.IL-22+CD4+T cells in patients with rheumatoid arthritis[J].International Journal of Rheumatic Diseases,2013,16(5):518-526.

[9]黄玉剑.复方风湿宁片治疗类风湿性关节炎疗效观察[J].辽宁中医药大学学报,2011,13(5):197-198.

[10]强建红.加味蠲痹汤联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎50例[J].陕西中医,2014,35(7):874.

[11]姚瑶,葛卫红.来氟米特活性代谢物teriflunomide联合甲氨蝶呤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的影响[J].医药导报,2013,32(7):839-842.

[12]刘志华,黄石,齐青松,等.类风湿性关节炎患者血清IL-17和IL-22的表达及临床意义[J].国际检验医学杂志,2014,35(1):14-16.

(收稿日期:2014-11-24)

文章编号1004-0188(2015)03-0026-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.011

中图分类号R 593.22

文献标识码A