胃炎口服液对Hp感染小鼠血清及胃黏膜细胞因子的影响



胃炎口服液对Hp感染小鼠血清及胃黏膜细胞因子的影响

李莉，李卫红，江恒，敬新蓉，卢海波，冯怀志，孙薏

[摘要]目的研究胃炎口服液对幽门螺杆菌(Hp)感染小鼠血清IL-2、IL-8及胃黏膜IL-8和IFN-γ的影响，探讨胃炎口服液治疗幽门螺杆菌相关性胃炎(HAG)的机制。方法实验小鼠被随机分为4组：正常对照组(D组)、模型对照组(C组)、丽珠维三联组(阳性对照，B组)和胃炎口服液组(A组)，每组15只。采用Hp菌液灌胃法制备Hp感染小鼠模型，D组用正常小鼠，后3组用模型小鼠进行实验。前两组给予等体积的生理盐水灌胃，后两组分别用丽珠维三联和胃炎口服液灌胃，均灌胃2 w。2 w后处死动物，观察各组小鼠胃黏膜病理学改变，ELISA检测血清IL-2和IL-8的水平以及胃黏膜IL-8和IFN-γ的含量。结果与C组比较，胃炎口服液(A组)能显著减轻HAG小鼠胃黏膜炎症，降低血清和胃黏膜IL-8及胃黏膜IFN-γ的含量(P<0.05)，并提高血清IL-2的水平(P<0.05)，但其作用尚不及丽珠维三联(B组)明显。结论胃炎口服液能调节IL-2和IL-8、IFN-γ之间的失调，进而对HAG有治疗作用。

[关键词]幽门螺杆菌；小鼠；胃炎口服液；IL-2；IL-8；IFN-γ

幽门螺杆菌(Hp)感染后发生的胃黏膜炎症称为幽门螺杆菌相关性胃炎(HAG)。据调查，Hp在全世界范围感染率超过50%，我国平均感染率为55%[1]。感染后患者很难自发清除，导致HAG的发生，其长期存在使得15%~20%患者出现消化性溃疡[2]，部分可进展为慢性萎缩性胃炎、胃癌等，严重影响患者的生活质量。最近研究发现，白介素(IL)等免疫细胞因子参与了HAG发生与发展过程并发挥重要作用[3]，其二者的关系已是近来研究的热点。现阶段两种抗生素加质子泵抑制剂三联疗法是治疗Hp感染的常选方案[4]，但抗生素的不良反应、Hp产生耐药、治疗费用较高等因素影响了HAG的治疗[5]。中药具有毒副作用轻、发生耐药低、肠道菌群失衡少等优点，本研究探讨了我院自制胃炎口服液对感染Hp小鼠致HAG相关细胞因子的作用，观察了胃炎口服液对HAG的效果。

1材料与方法

1.1实验动物雄性昆明种小鼠65只，约7 w龄，约19 g/只。购自四川大学华西医学中心(动物合格证号：0003276)。在本院实验楼动物科清洁级喂养，室温(23±2)℃，相对湿度为(55±5)%，每天光照黑暗交替各12 h。自由饮水、进食。

1.2主要试剂与仪器H.pylori(SS1)菌株由华西医学中心馈赠；Giemsa染液购自厦门鹭隆生物科技发展有限公司，快速尿素酶试剂盒购于珠海市克迪科技开发公司，用于检测血清指标的小鼠ELISA试剂盒(IL-2和IL-8)购于武汉华美生物工程有限公司，用于测定胃黏膜指标的小鼠ELISA试剂盒(IL-8和IFN-γ)购于联科生物科技有限公司，丽珠维三联组(枸橼酸铋钾片/替硝唑片/克拉霉素片组合装)购于丽珠集团丽珠制药厂，胃炎口服液由我院制剂室提供；自动酶标读数仪(型号Model550，美国Bio Rad公司)。

1.3Hp感染小鼠模型的建立及分组参照文献[6]方法，制备H.pylori菌液，采用H.pylori菌液灌胃法制备Hp感染小鼠模型，并检查小鼠胃部Hp感染。

实验小鼠被随机分为4组：正常对照组(D组)、模型对照组(C组)、丽珠维三联组(阳性对照，B组)和胃炎口服液组(A组)，每组15只。B组用丽珠维三联(每毫升含枸橼酸铋钾7.8 mg、替硝唑6.5 mg及克拉霉素3.25 mg)液体灌胃，0.4 ml/(只·d)；A组用仅含胃炎口服液0.078 ml的灌胃液0.4 ml灌胃，0.4 ml/(只·d)；D组和C组用等体积生理盐水灌胃；共2 w。

1.4取材与检测小鼠最后一次给药后，继续饮水、禁食12 h，然后处死取血，常温离心取上清液，按照试剂盒说明书用酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血清IL-8和IL-2的含量。剖腹取小鼠胃黏膜组织约450 mg，匀浆离心取上清液，同样用ELISA法检测小鼠胃黏膜IL-8和IFN-γ的含量。取胃组织切片，用苏木素-伊红染色，在光镜下观察胃黏膜的炎性程度，炎症活动程度计分方法见文献[6]。

2结果

2.1模型制备情况经尿素酶、Giesma染色和细菌学涂片等检测，结果显示本建模方法成功，Hp感染成功率100%。

2.2各组胃黏膜病变程度C组炎性程度最明显，与A、B两组对比均呈显著性差异(P<0.05)；经治疗后，A、B两组炎性程度明显减轻，但B组效果优于A组(P<0.05)，且与正常对照组D组无差别。见表1。

表1　各组胃黏膜病变程度(n=15)

注：与C组比较，①P<0.05；与A组比较，②P<0.05

2.3各组血清IL-2和IL-8的检测结果C组IL-2含量明显低于D组(P<0.05)，说明感染后，小鼠血清IL-2含量明显减少；A和B两组经治疗后血清IL-2较C组有显著增高(P<0.05)。C组IL-8含量显著高于D组(P<0.05)，说明感染后小鼠血清IL-8含量显著升高；A组和B组血清IL-8含量经治疗后较C组显著降低(P<0.05)。见表2。

表2　各组血清IL-2和IL-8的检测结果比较(n=15)

注：与C组比较，①P<0.05

2.4各组小鼠胃黏膜IL-8和IFN-γ的检测结果C组胃黏膜IL-8和IFN-γ含量均显著高于D组(P<0.05)，说明小鼠感染后胃黏膜IL-8和IFN-γ含量均明显增高；A、B两组经治疗后，胃黏膜IL-8和IFN-γ含量均明显较C组降低(P<0.05)，且B组治疗效果较A组好(P<0.05)。见表3。

表3　各组小鼠胃黏膜IFN-γ和IL-8含量的比较(n=15)

注：与C组比较，①P<0.05;与A组比较，②P<0.05

3讨论

研究药物抗Hp所致疾病的前提是构建价廉、稳定并能真实地模拟人胃Hp感染的模型动物，现常见的Hp的天然宿主动物因价格高、来源少、饲养条件苛刻等原因而不宜用于动物模型实验研究[7]。而来源便利、属系多样的小鼠，因体型小、易繁殖，成为动物模型的较好选择[8]，适合用于构建胃Hp感染动物模型。

本研究结果提示，我院自制的胃炎口服液有显著的治疗HAG的作用(A组)，与常用的西医三联疗法效果相近(B组)，并且对参与了HAG发生、发展的相关免疫细胞因子(IL-2、IL-8及IFN-γ)有明显改善作用。

胃黏膜感染Hp后，由于抗炎和促炎因子失衡，导致胃黏膜微环境改变，是引起Hp相关性胃病的主要原因之一。T淋巴细胞产生的细胞因子IL-2可促进T淋巴细胞克隆扩增，提高GM-CSF功能，增强LAK、NK细胞、杀伤性T淋巴细胞等的杀伤活性，协同刺激B淋巴细胞增殖及抗体的产生，所以，在机体的免疫系统调节中处于至关重要的地位。机体免疫状态可通过血清IL-2水平的高低体现[9]。研究显示，Hp感染患者因Th1细胞的增殖活性低，使其分泌的IL-2水平也低，导致免疫功能低下。

IL-8是Hp感染后的重要炎性介质之一，胃黏膜感染Hp后，IL-8的分泌增加，使得单核细胞等向受损部位趋化并激活，导致胃黏膜炎性反应，这可能是Hp相关胃炎的始动因素。研究显示，Hp感染者IL-8的水平与炎症程度呈正相关[10]。另外，Hp感染后，Th1免疫应答导致胃黏膜分泌大量IFN-γ，使中性粒细胞等炎细胞的活性增强，产生多种细胞因子及炎症递质等，导致胃黏膜上皮受损。因而，降低IFN-γ 水平有助于Hp感染相关炎症的控制[3]。

胃炎口服液是复方中成药，对常见的胃部疾患有较好疗效。可明显降低Hp感染后所致的血清和胃黏膜IL-8升高，降低胃黏膜IFN-γ水平，以及增高血清IL-2水平。其主要原因可能与胃炎口服液的一些重要组分有关。茯苓、南沙参、丹参和黄芩等中药是胃炎口服液的主要成分，其中多味中药都具有免疫调节作用，如南沙参、黄芩和茯苓等。它们可增强小鼠的免疫功能，激发胃肠道的免疫系统，平衡抗炎和促炎细胞因子，进而保护胃肠道，抵御Hp对胃黏膜的侵害[11-12]。

综上所述，胃炎口服液能调节免疫系统，纠正细胞因子失衡，减轻炎性反应，提高机体免疫，缓解Hp感染后所致胃炎。其治疗效果与常用的西医三联疗法效果相近，并为纯中药制剂，不易耐药、副作用小，有较好的应用前景。

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[6]李莉,冯怀志,李硕,等.胃炎口服液治疗幽门螺旋杆菌感染小鼠的实验研究[J].泸州医学院学报，2014,37(4):357-360.

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Effect of Gastritis Oral Liquid on serum and gastric mucosal cytokines of mice with Hp infection

Li Li1,Li Weihong2,Jiang Heng1,Jing Xinrong1,Lu Haibo1,Feng Huaizhi1,Sun Yi11.Department of Oncology,Hospital 452 of PLA,Chengdu,Sichuan,610021,China;2.Medial Squadron,Logistics Department,Sichuan Provincial Military Command,Chengdu,Sichuan,610000,China

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of Gastritis Oral Liquid on serum IL-2 and IL-8 as well as gastric mucosal cytokines IL-8 and IFN-γ of mice withHelicobacterpylori(Hp)infection,and explore the mechanism of Gastritis Oral Liquid in the treatment ofHelicobacterpylori-associated gastritis(HAG).MethodsKunming mice models infected by human Hp were built by intragastric Hp administration.All the mice were randomly divided into 4 groups:normal control group(group D),model control group(group C),Lizhuwei Sanlian group(positive group,group B),and Gastritis Oral Liquid group(group A;n=15 per group).They were treated with:group A:Gastritis Oral Liquid;group B:Lizhuwei Sanlian;group C:normal saline;group D:normal saline.The treatments were carried out once a day for 2 weeks for each group,and then these mice were killed in order to observe the pathological changes of the mice's gastric mucosa and detect the serum levels of IL-2 and IL-8 and contents of gastric mucosal cytokines IL-8 and IFN-γ by ELISA.ResultsCompared with group C,Gastritis Oral Liquid reduced significantly the HAG mice gastric mucosa inflammation,reduced the serum levels of IL-8 and contents of gastric mucosal cytokines IL-8 and IFN-γ(P<0.05),and increased the serum levels of IL-2(P<0.05).But the effects of Gastritis Oral Liquid was less than that of Lizhuwei Sanlian.ConclusionGastritis Oral Liquid may play a protective effect on the gastric mucosa in HAG mice through adjusting the balance of cytokine network,maintaining the balance between the anti-inflammatory cytokines(IL-2)and pro-inflammatory cytokines(IL-8 and INF-γ).

[Key words]Helicobacterpylori;mouse;Gastritis Oral Liquid;IL-2;IL-8;IFN-γ

(收稿日期:2015-01-14)

文章编号1004-0188(2015)02-0129-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.02.006

中图分类号R 285.6

文献标识码A

通讯作者:孙薏，E-mail:yi_sun307@yahoo.com.cn

基金项目:成都军区十二五重点项目(B12011)
作者单位:610021 成都，解放军452医院肿瘤科(李莉，江恒，敬新蓉，卢海波，冯怀志，孙薏)；四川省军区后勤部卫生所(李卫红)