兔MSCs移植对兔角膜缘干细胞形态、增殖、分化的影响



兔MSCs移植对兔角膜缘干细胞形态、增殖、分化的影响

余锦强,李凌,李儒华,柯峰,李芳,邵杰

[摘要]目的探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对兔角膜缘干细胞形态、增殖、分化的影响。方法无菌条件下取兔骨髓,分离得到兔MSCs。取培养3代后MSCs消化后制成细胞悬液,接种于羊膜植片上,常规培养。建立兔角膜碱烧伤干细胞缺损模型4 w后,将18只新西兰兔随机分为空白组、MSCs移植组和模型组,每组6只。MSCs移植组和模型组分别用尼龙缝线将空白和带有兔MSCs的羊膜基质植片间断缝合固定于浅层巩膜上,空白组不做处理。术前、术后观察实验兔眼表形态,并进行评分。术后4 w处死动物,免疫组化检查细胞角蛋白AE5表达情况。结果筛选得到的兔MSCs细胞均一性达98.12%；术后MSCs移植组兔眼表形态综合评分显著降低,而模型组无显著变化,同期与模型组综合评分相比,均显著低于模型组(P<0.05)；免疫组化检测结果显示,空白组和MSCs移植组AE5阳性表达率均为100.00%,显著高于模型组(P<0.05)。结论以羊膜基质为载体移植MSCs治疗角膜缘干细胞缺乏症,可增殖分化为角膜上皮细胞而发挥功能,疗效显著,可为其临床应用提供理论基础。

[关键词]骨髓；间充质干细胞；角膜缘；干细胞缺损；增殖；分化

眼部的酸碱化学烧伤等多种原因,可以导致角膜缘干细胞缺损,从而引起角膜表面持续性结膜上皮化,进而出现角膜上皮缺损[1]。目前,对角膜缘干细胞缺损的治疗主要包括角膜缘干细胞同种异体移植和自体移植。虽然获得一定的临床效果,但是都具有一定的局限性[2-3]。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因具有高增殖性、多项分化潜能诸多优点而备受关注,但是在眼科领域应用较少[4-5]。本研究探讨了兔MSCs移植对兔角膜缘干细胞形态、增殖、分化的影响,期望能为其临床应用提供理论基础。

1材料与方法

1.1实验动物健康新西兰兔18只购自北京大学医学院动物实验中心(合格证编号：101304253),体重为2.0~2.5 kg,饲养温度为20~25 ℃,自然光照。

1.2主要试剂和仪器鼠抗兔CD45、鼠抗兔CD29、鼠抗兔CD34和鼠抗兔AE5单克隆抗体(Epigentek公司),FITC和Cy3标记荧光二抗(美国Sigma-Aldrich公司),氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、Envision二步法免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),FACSCALIBUR流式细胞仪。

1.3方法

1.3.1兔MSCs的分离培养无菌条件下取兔髂骨骨髓,加入5 ml基本培养基混匀后,离心(1000 r/min×10 min),弃上清,重复3~5次。DMEM培养基重悬细胞,细胞计数,接种后于培养箱中培养。

1.3.2兔MSCs的鉴定分离得到的MSCs培养3代后,消化后制成细胞悬液,调整细胞密度(1×105/L)接种于24孔板,每隔24 h于其中3孔培养板中加入Trypsin-EDTA液,消化制成细胞悬液后计数,绘制细胞生长曲线。另取培养3代后MSCs消化后制成细胞悬液,PBS洗涤3~5次,加入荧光标记的鼠抗兔CD45单克隆抗体,鼠抗兔CD29单克隆抗体,鼠抗兔CD34单克隆抗体,孵育30 min,于流式细胞仪检测。

1.3.3羊膜的制备与种植MSCs无菌条件下取健康足月剖腹产产妇的羊膜,按参考文献[6]方法清洗处理,于显微镜下观察证实无细胞残存。无菌条件下,平铺于6孔培养板中备用。取培养3代后MSCs消化后制成的细胞悬液,接种于羊膜植片上,常规培养[7]。

1.3.4兔角膜碱烧伤干细胞缺损模型的建立及鉴定常规方法麻醉兔后,无菌干棉球吸角膜表面液体。取预先浸泡于1 M NaOH的圆形滤纸,沥干后覆盖于实验兔的一只眼球角膜中央,1 min后取下,用生理盐水清洗无菌干棉球吸角膜表面液体,即为兔角膜碱烧伤干细胞缺损模型。每天观察记录结膜炎症、眼球粘连、角膜基质溶解、穿孔等情况。

1.3.5兔MSCs移植实验上述模型建立4 w后,将18只新西兰白兔随机分为3组：空白组、MSCs移植组和模型组,每组6只。MSCs移植组和模型组兔采用常规麻醉,切除兔眼角膜及角膜缘表面的坏死组织,暴露基质浅层,沿角膜缘环形剪开球结膜,暴露角膜缘后4 mm处的巩膜；分别用10-0尼龙缝线将带有兔MSCs或空白的羊膜基质植片间断缝合固定于浅层巩膜上,其边缘超出角膜缘约2~3 mm。术后金霉素眼膏涂于眼部,行睑裂缝合。空白组不做处理。

1.3.6眼表形态评分角膜新生血管：无新生血管为0分,新生血管位于角膜缘内2 mm为1分,新生血管位于角膜周边≤1/2象限为2分,新生血管位于角膜周边>1/2象限为3分,全角膜可见新生血管生长为4分；角膜浑浊度：角膜透明无浑浊为0分,轻度浑浊为1分,中度浑浊为2分,重度浑浊为3分,极度浑浊为4分。

1.3.7免疫组化检查手术后4 w处死动物,取角膜组织,2 h内完成标本取材,标本均经10%甲醛固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋,备用。切片脱蜡至水,HE染色后观察。采用Envision二步法进行AE5表达定位及半定量分析,严格按试剂盒说明书进行操作。每张切片随机抽取5个高倍镜下视野,计算阳性细胞百分数。

1.4结果判定应用彩色病理图像分析系统,在高倍镜下测定免疫组化结果。切片中出现棕黄或棕黑色物为CD45、CD29及CD34阳性染色,不着色为阴性。按阳性染色面积进行分级,Photoshop软件图像分析测量阳性染色区域占总面积的百分比。所有区域阳性染色面积<10%为(-),在11%~50%为(+),在51%~80%为(++),>81%为(+++)。

1.5统计学方法所有资料采用SPSS 13.0进行分析处理,计数资料采用χ2检验；计量资料以均数±标准差表示,行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1生长曲线兔MSCs体外培养生长曲线见图1。原代兔骨髓间充质干细胞接种3~4 h后开始贴壁,24 h大量贴壁；2~3 d见部分集落形成,大多数细胞有胞浆突起；5~7 d集落迅速增多,以梭形细胞为主,胞浆丰富、核大,细胞呈平行排列或漩涡状生长。

图1　兔MSCs体外培养生长曲线

2.2兔MSCs的鉴定流式细胞仪检测结果显示(表1),培养的兔骨髓来源的细胞是兔MSCs,不含有造血系细胞。

表1　流式细胞仪检测结果

2.3效果评价术前模型组和MSCs移植组眼表形态综合评分显著高于空白组,表明模型建立成功。术后MSCs移植组兔眼表形态综合评分显著降低,而模型组无显著变化,同期与模型组相比,均显著低于模型组。见表2。

表2　不同时间各组眼表形态综合评分比较

注：与本组术前相比,①P<0.05；与同期模型组相比,②P<0.05

2.4免疫组化结果空白组和MSCs移植组AE5阳性表达率均为100.00%,显著高于模型组(P<0.05,表3)。

表3　免疫组化检测AE5表达结果(只)

注：与模型组相比,①P<0.05

3讨论

角膜上皮层位于角膜表面,健康的机体,角膜上皮层可不断脱落、更新,当角膜上皮受到损伤后,自身也能在角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)的帮助下快速完成修复。Schermer最早发现角膜上皮细胞均表达细胞角蛋白(CK3),证明了角膜缘干细胞的存在,其主要位于角膜缘基底处的“vogt”栅栏区[8]。

研究表明,MSCs具有多项分化能力,一方面与其多能性有关,另一方面与其所处环境有关[9]。前者是MSCs本身内在的特性所决定的,如与多能性有关的基因的开启；后者主要是与其微环境中的信号分子有关。如VEGF促进MSCs向血管内皮分化,MSCs与某种细胞接触或共培养后,MSCs呈现出此细胞的特征。如MSCs向神经细胞分化。本研究中筛选得到的兔MSCs细胞均一性达98.12%,表明本实验培养的细胞为MSCs。

MSCs可在体外诱导分化为上皮细胞,体内实验研究亦证明了这一点。本研究发现,术前模型组和MSCs移植组眼表形态综合评分显著高于空白组,表明模型建立成功。术后MSCs移植组兔眼表形态综合评分显著降低,而模型组无显著变化,同期与模型组相比,均显著低于模型组,提示MSCs移植组体内MSCs分化成角膜干细胞,具有上皮细胞的特征。戢维颖[6]在体外成功诱导兔MSCs分化成角膜上皮细胞,与本研究结果一致。免疫组化检测结果进一步证明了这一点,空白组和MSCs移植组AE5阳性表达率均为100.00%,显著高于模型组(P<0.05)。AE5为角膜上皮细胞的标志蛋白,直接证明了角膜上皮细胞的存在,与卢建民[7]结论一致。

研究证实,在含角膜纤维细胞的胶原凝胶上培养角膜上皮细胞,其增殖分化良好。而在缺乏角膜纤维细胞时,其增殖分化能力受到影响,出现功能缺陷[6]。角膜基质可作为角膜上皮细胞和角膜缘干细胞生长的微环境,诱导胚胎干细胞和皮肤干细胞定向分化,重建角膜上皮。而MSCs不仅可分化为角膜上皮细胞,而且具有为角膜缘干细胞的生长发育提供营养支持的作用,甚至维持角膜缘干细胞功能的稳态。

综上所述,以羊膜基质为载体移植MSCs治疗角膜缘干细胞缺乏症,可增殖分化为角膜上皮细胞或角膜上皮细胞样细胞而发挥功能,疗效显著,可为其临床应用提供理论基础。但由于缺乏临床试验,本结论尚有待于进一步的证实。

【参考文献】

[1]潘凤,李志强,杨晓勤.角膜缘干细胞移植与单纯球结膜瓣移植治疗翼状胬肉疗效比较[J].实用防盲技术,2014,9(1):13-15.

[2]刘小勇,张晓玲,周清,等.自体角膜缘干细胞移植和羊膜移植治疗翼状胬肉的疗效及安全性[J].中国老年学杂志，2014,34:3517-3520.

[3]Zhong H,Cha XP,Wei T,et al.Prevalence and risk factors for pterygium in rural adult Chinese populations of the Bai Nationality in Dali:the Yunnan Minority Eye Study[J].Invest Opthalmol Vis Sci,2012,53:6617-6621.

[4]齐文娟.骨髓间充质干细胞迁移分化为角膜上皮样细胞的初步研究[D].广州：暨南大学,2013.

[5]Kassem M.Mesenchymal stem cells:biological characteristics and potential clinical applications[J].Cloning Stem Cells,2004,6(4):369-374.

[6]戢维颖.体外诱导骨髓间充质干细胞与羊膜构建角膜上皮细胞移植片用于眼表重建[D].西安：第四军医大学西京医院眼科全军眼科研究所,2008.

[7]卢建民.兔骨髓间充质干细胞移植治疗角膜缘干细胞缺损的实验研究[D].大连：大连医科大学,2007.

[8]Sehlotzer-Sehrehardt U,Kruse FE.Identification and characterization of limbal stem cells[J].Exp Eye Res,2005,27:1-18.

[9]张丽娟.翼状胬肉角膜缘干细胞移植术后眼表改变的临床观察[J].中国临床研究,2014,27(4)：460-461.

Effect of MSCs transplantation on morphology,proliferation,and differentiation of rabbit corneal limbal stem cell

Yu Jinqiang,Li Ling,Li Ruhua,Ke Feng,Li Fang,Shao JieDepartment of Ophthalmology,Affiliated Shiyan People's Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei,442000,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)transplantation on morphology,proliferation,and differentiation of rabbit corneal limbal stem cell.MethodsRabbit bone marrow was obtained under sterile conditions and MSCs were obtained by isolation.Cell suspension was prepared after digestion of MSCs cultured for three generations and inoculated in the amniotic membrane graft,and conventional culture was provided.And then,a rabbit corneal alkali burn stem cell defect model was built.After four weeks,18 New Zealand rabbits were randomly divided into blank group,MSCs transplantation group and model group(n=6 per group).For the MSCs transplantation group and model group,nylon suture was used to fix the amniotic membrane grafts with and without MSCs discontinuously to the superficial sclera,and no treatment was provided for the blank group.The preoperative and postoperative ocular surface morphology of the experimental rabbits were observed and scores were kept.The rabbits were put to death after four weeks since the operation,and immunohistochemistry method was used to examine the expression of cytokeratin AE5.ResultsThe homogeneity of rabbit MSCs obtained by screening reached to 98.12%;The comprehensive scores of postoperative ocular surface morphology of the rabbits in the MSCs transplantation group decreased significantly,while the model group did not change significantly;compared with the model group,the comprehensive scores in the same period were all significantly lower than that in the model group(P<0.05);immunohistochemistry results showed that the positive expression rates of AE5 in the blank group and MSC transplantation group were 100.00%,significantly higher than that in the model group(P<0.05).ConclusionTaking amniotic membrane matrix as a carrier for MSCs transplantation in treatment of corneal limbal stem cell deficiency is available for proliferation and differentiation of corneal epithelial cells,and the curative effect is obvious;this provides theoretical basis for the clinical application.

[Key words]bone marrow;mesenchymal stem cells;corneal limbal stem cell defect;proliferation;differentiation

(收稿日期:2014-10-31)

文章编号1004-0188(2015)02-0134-04

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.02.008

中图分类号R 779.65

文献标识码A

通讯作者:邵杰,电话：13733573141；E-mail：swhmv-526@163.com

基金项目:十堰市科学技术研究与开发项目[十科发(2010)23号2010-014z]
作者单位:442000 湖北 十堰,湖北医药学院附属人民医院眼科