UPLC-MS/MS法测定虾蟹中4-己基间苯二酚的残留量

唐利平，邓启华，谢家理

（四川化工职业技术学院，四川 泸州 646005）

UPLC-MS/MS法测定虾蟹中4-己基间苯二酚的残留量

唐利平，邓启华，谢家理

（四川化工职业技术学院，四川 泸州 646005）

建立一种超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定虾蟹中4-己基间苯二酚残留量的检测方法。样品经乙腈超声提取，C18固相萃取柱净化后，UPLC BEH C18色谱柱分离，多反应监测方式测定，外标法定量。结果显示：加标回收率在88.32%～92.08%之间，相对标准偏差RSD≤2.3%；以S/N=3计算，检出限为5.0μg/kg。该法灵敏度好、准确性高、精密度好、检出限低，适用于虾蟹中4-HR微量和痕量残留的测定。

4-己基间苯二酚；UPLC-MS/MS；虾蟹；残留量

0 引 言

4-己基间苯二酚（4-Hexylresorcinol，4-HR，分子式为C12H18O2，CAS号136-77-6。4-HR可作为抗氧化剂、色素稳定剂、酶褐变抑制剂、加工助剂等，因高效抑制多酚氧化酶褐变而被用于水产品保鲜加工[1-3]。我国自1996年将4-HR纳入GB 2760——1996《食品添加剂使用卫生标准》，规定4-HR作为抗氧化剂，在鲜水产中（仅限虾类）可按生产需要适量使用，残留量≤1 mg/kg；2014年12月，国家卫计委发布GB 2760——2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，4-HR仍为我国合法食品添加剂之一，其质量安全监测属于日常监督范围。

目前，国内外对4-HR的检测方法主要是高效液相色谱-荧光法和气相色谱法[4-6]，但无论是液相还是气相的检测器，仅能提供保留时间及紫外光图谱等信号，而对未知成分所能提供的结构信息相当有限，对食品、水产品等复杂基质体系的定性结果可能给出错误的结论而导致误判。质谱（MS）是一种高灵敏度的检测器，可用于解析未知化合物的结构，而超高效液相色谱-质谱法就是将超高液相的高分离效能与MS强大结构测定功能结合，用于化合物的准确定量定性，这为食品成分的准确分析提供了一个重要的新技术[7]。

本文以虾、蟹为研究对象，采用超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS），摸索建立虾蟹中4-HR的检测方法，该法灵敏度好、准确性高、精密度好，适用于虾蟹中4-HR微量和痕量残留量的测定，为日常虾蟹质量安全监督检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾、蟹原始样品，购自当地农贸市场。

4-己基间苯二酚标准品（纯度99.5%，美国Dr. Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇、正己烷（色谱纯，德国默克公司）；氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）；实验用水为18.2MΩ·cm超纯水。高纯氮气、氩气、液氮均购自四川泸州市气体厂。

4-己基间苯二酚标准储备液：准确称取0.0500g肌醇标准品（准确至0.1 mg），用乙腈溶解定容至100mL，即配成0.5mg/mL的标准储备液，-18℃保存备用。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Waters公司，ACQUITY UPLC XEVO TQ MS型）；电子分析天平（瑞士Mettler公司，XS-205型）；超纯水器（美国密理博公司，Advantage A10型）；恒温干燥箱（德国 Bingder，ED-115型）；氮吹仪（长沙中迅电子工程研究所，HCG-36型）；漩涡振荡器（广州仪科实验室技术有限公司，MS2 Minshaker型）；有机微孔滤膜（天津津腾试验设备有限公司，0.22 μm）；C18固相萃取柱（博纳艾杰尔科级有限公司，500mg/3mL型）。

1.3 UPLC-MS/MS条件

仪器系统：Waters UPLC XEVO TQ MS；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm×1.7μm）；柱温：35℃；样品室温度：10℃；流量：0.2 mL/min；流动相A：乙腈；流动相B：水（含0.1%甲酸）；梯度见表1。电离模式：ESI-；喷雾电压：2.8kV；脱溶剂气：氮气，800L/h，450℃；锥孔气：氮气，50 L/h；碰撞气：氩气；源温度：150℃；采集模式：多反应监测（MRM）；定性离子对（m/z）：194.2/123.0；定量离子对（m/z）：194.2/41.0；锥孔电压：25V；碰撞电压：15V。

1.4 样品前处理

试样制备：从原始虾、蟹样品中取具有代表性的样品，虾类去头、壳，蟹类去壳，取可食部分用高速分散匀质机粉碎匀浆，-18℃以下冷冻保存备用。

表1 流动相梯度表

提取：精确称取试样5 g（感量0.1 mg）于50 mL离心管中，加入15mL乙腈漩涡振荡1min，超声提取20min，再加入2g氯化钠漩涡振荡2min。4000r/min离心15min，移取提取液于100mL鸡心瓶中。残渣用30mL乙腈重复提取2次，合并提取液，40℃旋转蒸发至干。用4%氯化钠溶液5mL溶解残留物，加正己烷5mL震荡混合1min，静置分层，弃上层正己烷液，下层液备用。

净化：取C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，取备用液过柱，控制流速2 mL/min，用5mL水淋洗，抽干，5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45℃氮气吹干。用65%乙腈1.0mL溶解残留物，漩涡振荡1 min，有机微孔滤膜过滤，供UPLC-MS/MS分析。

1.5 标准曲线绘制

分别准确移取4-己基间苯二酚标准液（10μg/mL）10，20，50，100，200μL于10mL容量瓶中，用乙腈定容，依次配制成10，20，50，100，200 ng/mL标准工作液，按1.3 UPLC-MS/MS条件上机测定。特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，4-HR标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的确定

根据4-HR微溶于水而易溶于有机溶剂的特点，选择甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、环己烷5种提取溶剂，探讨其对虾蟹中4-HR提取率的影响。从表2中可知：5种试剂均可提取4-HR，但其提取效果有所差异，其中甲醇和乙醇提取的杂质太多，特别是极性强的杂质较多，对4-HR的测定存在干扰，且提取率不高；乙腈、乙酸乙酯和环己烷均能很好地萃取4-HR，但乙酸乙酯和环己烷萃取时会带入大量脂溶性杂质和干扰峰，且无法萃取已溶于水相中的4-HR，造成4-HR流失；而乙腈可较好地提取虾蟹样品中的4-HR，杂质较少，未见干扰峰，故本文选择乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化柱的确定

选择固相萃取柱C18柱、中性氧化铝柱、石墨化碳粉柱、氨基柱、二醇柱等为净化柱，比较分析其净化差异，结果显示：固相萃取柱C18柱、中性氧化铝柱和二醇柱均能较好地去除样品中的杂质和富集4-HR，尤其C18柱富集4-HR效果最佳，柱回收率达91.3%。因此，本方法选择C18柱为净化柱。

2.3 超高效液相色谱条件优化

比较分析了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-水（0.1%甲酸）作为流动相时色谱图基线、峰型、4-HR与杂质干扰峰的分离效果，结果表明：这4种流动相体系都能使4-HR峰和样品中杂质峰有效分离、基线平稳、峰型对称，尤其是乙腈-水（0.1%甲酸）体系，峰型、基线、分离效果均最佳，而且由于使用0.1%甲酸而抑制水相中微生物的滋生，延长了流动相使用期限，如图1所示。

图1 4-HR超高效液相色谱图

不同比例的乙腈-水（0.1%甲酸）流动相体系，会影响4-HR与杂质干扰峰的分离效果，经优化筛选获得较佳的流动相梯度条件 （见表1），4-HR分离度＞1.5，基本不受杂质峰的干扰，且出峰时间适中，峰宽窄，峰型对称尖锐（见图1）。

2.4 质谱条件优化

由于4-HR属于弱酸性物质，通常采用ESI-进行分析。为使4-HR能达到良好的电离效果，以乙腈-0.1%甲酸水（65∶35，ν∶ν）为溶解液，配制1.0μg/mL的4-HR标准溶液，用注射泵以10μL/min的流速进入质谱仪离子源，负离子模式进行一级质谱扫描，确定分子离子峰；以分子离子峰为母离子，通过优化喷雾电压、脱溶剂气流速和温度、锥孔气流速和温度等参数使得母离子强度最大。之后经优化碎裂电压，使碰撞能达到最佳条件，选择采集模式为多反应监测，源温度为150℃，碰撞气为氩气，锥孔电压为25 V，碰撞电压为15V，分别对分子离子进行二级质谱分析（子离子扫描），得到碎片的离子信息，获得强度较大的3个子离子对（m/z），分别为定性离子对（m/z）为194.2/123.0（信号较强的子离子作为定性离子）；定量离子对（m/z）为194.2/41.0（离子丰度强的子离子作为定量离子）。在上述色谱质谱条件下，4-HR标准溶液、空白样品、加标样品的多反应监测色谱图峰型对称尖锐，峰型良好，未见明显的干扰峰（见图2）。

图2 4-HR超高效液相色谱-质谱图

2.5 线性关系及检出限

在标准曲线线性范围10～200μg/mL时，线性回归方程：y=70.4907x+305.623，相关系数r2=0.9991，这表明4-HR在10～200 μg/mL范围内，4-HR质量浓度与特征离子质量色谱峰面积有较好的线性关系。通过对添加低质量浓度水平的4-HR标准溶液的空白虾蟹样品进行连续测定，以3倍信噪比计算方法的检出限为5.0μg/kg（见图3）。

图3 4-HR标准曲线

2.6 回收率和精密度

以鲜虾样品为例，分别添加4-HR标准溶液10，50，100μg/mL，进行6次平行测定，研究加标回收率和精密度（见表3）。由表可知：本方法3种水平的加标回收率分别为88.32%、91.61%和92.08%，相对标准偏差（RSD）≤2.3%，这说明本文所建立的UPLCMS/MS测定4-HR的方法，回收率高、准确度高、精密度好。

表3 回收率和精密度（n=6）

2.7 实际样品测定

依照上述样品前处理操作步骤和UPLC-MS/MS参数条件，对市售的30种虾蟹样品进行测定，结果表明：来源于不同商家的虾蟹样品中，4-HR残留量差别较大。其中，虾样品中4-HR残留量最高值为21.35mg/kg，最低值为0.14mg/kg，平均值为1.73mg/kg；蟹样品中4-HR残留量最高值为2.35mg/kg，最低值为0.01 mg/kg，平均值为0.13 mg/kg。这表明在实际虾、蟹类水产品的加工过程中，4-HR通常被作为抗氧化剂添加使用，主要用于防止虾蟹样品在预售期（贮存、运输）中由于多酚氧化酶的催化而发生的氧化褐变或色泽变黑，由此可见，为了确保虾蟹质量安全和维护公众身体健康，有必要对4-HR残留量加强监督。

图4 虾中4-HR残留量测定色谱图

3 结束语

本文成功建立了一种超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）法测定虾蟹中4-HR残留量的检测方法，加标回收率在88.32%～92.08%之间，相对标准偏差（RSD）≤2.3%，检出限为5.0μg/kg。该法灵敏度好、准确性高、精密度好，适用于虾蟹中4-HR微量和痕量残留量的测定，为日常虾蟹质量安全监督检测提供技术支撑。

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Determination of residues of 4-Hexylresorcinol in shrimp and crab by UPLC-MS/MS

TANG Liping，DENG Qihua，XIE Jiali
（Sichuan Vocational College of Chemical Technology，Luzhou 646005，China）

A method fordetermining the residues of 4-Hexylresorcinolin shrimp and crab was established by an ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS/MS）. Samples were ultrasonic extracted with acetonitrile，and purified with C18 solid phase extraction，and separated by UPLC BEH C18 column，and measured by multiple reaction monitoring mode，and quantitative by external standard.The results show that：the recoveries between 88.32%～92.08%，and the relative standard deviation（RSD）were no more than 2.3%；According toS/N=3，the detection limitwas5.0 μg/kg.Thismethod wassensitivity，high accuracy，precision，and low detection limit for the determination of 4-HR minor and trace residues in shrimp and crab.

4-Hexylresorcinol；UPLC-MS/MS；shrimp and crab；residues

A

：1674-5124（2015）07-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.07.014

2014-12-07；

：2015-01-09

唐利平（1969-），女，四川广安市人，副教授，硕士，研究方向为应用化学与环境科学。