APC、p53、K-ras在结直肠肿瘤检测中的研究价值

肖　丹，钟选芳，许岸高

(惠州市第一人民医院消化内科，广东 惠州 516001)



APC、p53、K-ras在结直肠肿瘤检测中的研究价值

肖丹，钟选芳，许岸高※

(惠州市第一人民医院消化内科，广东 惠州 516001)

摘要：目的采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染法检测腺瘤多发性息肉病(APC)、p53、K-ras三个基因在结直肠肿瘤筛查中的敏感性和特异性。方法选择2011年11月至2012年8月惠州市第一人民医院消化门诊收治的14例结直肠癌(CRC组)，60例结直肠腺瘤(CRA组)，30例正常组粪便标本，提取DNA，PCR-SSCP银染法检测基因突变。结果APC、p53、K-ras三个基因联合检测在CRC组、CRA组、正常组突变率分别为57.1%(8/14)、30.0%(18/60)、3.3%(1/30)；在结直肠肿瘤的灵敏度和特异度分别为35.1%(26/74)、96.7%(29/30)，粪便DNA联合检测CRC组、CRA组的检出率高于正常组(均P<0.05)。结论粪便DNA联合检测在无创性筛查结直肠肿瘤中具有可行性，可能是一种适合于结直肠肿瘤筛查的无创性方法和筛查模式。

关键词：结直肠肿瘤；粪便DNA；聚合酶链反应-单链构象多态性；腺瘤多发性息肉病基因；p53；K-ras

粪便DNA检测是目前除粪便隐血试验以外唯一非侵入性检查方法，用于结直肠肿瘤的筛查,是近年来的研究热点。目前认为93%的结直肠癌来源于结直肠腺瘤，从腺瘤发展成癌需3～17年，此自然病程为结直肠肿瘤的筛查发现癌前病变提供了时间基础[1]。近年来，结直肠肿瘤的发病率和病死率有逐年上升的趋势，而筛查可降低结直肠肿瘤的发病率和病死率[2]。目前，亟需一种人群依从性高、敏感性和特异性高的检测方法应用于临床推广。本研究主要探讨粪便DNA检测在结直肠肿瘤筛查中的研究价值。

1资料与方法

1.1一般资料选择2011年11月至2012年8月惠州市第一人民医院消化门诊收治的14例结直肠癌(colorectal cancer，CRC)组，60例结直肠腺瘤(colorectal adenoma，CRA)组，30例正常组粪便标本。本研究经医院伦理委员会批准，患者在检查前均先签署知情同意书。

1.2纳入、排除标准纳入标准[3]：①主动到医院进行健康体检的个体。②有结直肠癌高危因素的个体，包括年龄50 岁以上；溃疡性结肠炎或克罗恩病不愈10年以上；既往有结直肠癌病史或结直肠腺瘤史；胆管疾患及胆囊切除10年以上；下腹部放疗史10年以上；结肠慢性血吸虫病史；慢性阑尾炎病史；一级亲属患有结直肠癌者，年龄≥亲属结直肠癌诊断年龄-10岁(即比患结直肠癌者年轻10岁的一级亲属为高危人群)；遗传性非腺瘤性结肠癌家系的成员，年龄≥10岁；一级亲属有家族性息肉病者，年龄≥10岁。排除标准：①非自愿参与的患者。②结直肠肿瘤症状的患者：腹痛、黏液血便、排便习惯改变。③已确诊为“结直肠癌” 或“结直肠息肉”的患者。以上所有标本均为新鲜标本-80 ℃保存，诊断结果均经病理证实。以全结肠镜检查(型号Japan Olympus CF260)和病理组织学检查为诊断大肠肿瘤的金标准，粪便和组织DNA检测及结肠检查均采用盲法进行。

1.3方法采用TIANgen生物有限公司粪便基因组DNA提取试剂盒提取DNA，上海英骏生物公司设计并合成引物(表1)，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(ploymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)银染法检测腺瘤多发性息肉病(adenomatous polyposis,APC)、p53、K-ras基因突变，以某一基因单链条带位置改变与正常组织相比超过3 mm以上，或出现异常条带，则视为有突变。了解粪便DNA在结直肠肿瘤检测中的突变情况。

1.4统计学方法用EpiData 3.1建立数据库，采用SPSS 17.0 统计软件包进行统计学处理，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1APC基因、p53基因和K-ras基因在CRC组、CRA组、正常组中的突变差异APC基因在CRC组、CRA组、正常组的突变率比较差异无统计学意义(P>0.05)。在CRC组的灵敏度为21.4%(3/11)，特异度为85.6%(77/90)；结直肠肿瘤的灵敏度为20.3%(15/74)，特异度为96.7%(29/30)。见表2。

表1　APC、p53、K-ras基因引物序列及PCR产物片段长度

APC:腺瘤多发性息肉病;PCR:聚合酶链反应

p53基因在CRC组、CRA组、正常组的突变率比较差异有统计学意义(P<0.05)，CRC组、CRA组均高于正常组，差异有统计学意义(χ2=14.296，8.289，均P<0.05)。在CRC组的灵敏度为50.0%(7/14)，特异度为84.4%(76/90)；在结直肠肿瘤中的灵敏度为28.4%(21/74)，特异度为100.0%(30/30)。见表2。

K-ras基因CRC组、CRA组、正常组的突变率比较差异有统计学意义(P<0.05)，CRC组、CRA组均高于正常组，差异有统计学意义(χ2=14.887，5.625，均P<0.05)。在CRC组的灵敏度为42.9%(6/14)，特异度为88.9%(80/90)；在结直肠肿瘤中的灵敏度为21.6%(16/74)，特异度为100.0%(30/30)。见表2。

2.2APC基因、p53基因和K-ras基因联合检测在CRC组、CRA组、正常组中的突变差异三个基因联合检测在CRC组、CRA组、正常组的突变率比较差异有统计学意义(P<0.05)，粪便DNA联合检测CRC、CRA的突变率均高于正常组，差异有统计学意义(χ2=13.840，8.540，均P<0.05)。粪便DNA联合检测CRC的灵敏度为57.1%(8/14)，特异度为78.9%(71/90)；粪便DNA联合检测结直肠肿瘤的灵敏度为35.1%(26/74)，特异度为96.67%(29/30)。见表2。

表2　DNA单独与联合检测在CRC组、CRA组、正常组的检出率比较

CRC：结直肠癌；CRA：结直肠腺瘤；APC：腺瘤多发性息肉病；a与正常组比较，P<0.05;b与CRA组比较，P<0.05

2.3基因测序结果用PCR-SSCP银染法检测发现，突变的APC、p53、K-ras基因与基因测序结果一致率为100.0%(图1)。APC电泳突变分析显示,5、6号为电泳有突变的标本(图2A)，K-ras中8、9号为电泳有突变的标本(图2B)，p53中2、3号为电泳有突变的标本(图2C)，余为未见电泳突变的标本。

图1　基因测序结果

图2　APC 1061del、K-ras exon3 和p53 exon6在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳突变分析(29∶1)　2A：APC 1061del;2B：K-ras exon3;2C：p53 exon6; N：正常标本；A：腺瘤标本；T：癌标本

3讨论

结肠镜及病理组织学检查是诊断肠道疾病的金标准，但结肠镜为侵入性的有创检查，较多的患者因害怕而拒绝行结肠镜进一步检查[4]，从而错失了发现结直肠肿瘤早期病变的最佳时机。CRC是一个多基因、多阶段、多步骤的的发生过程，自1992年首例CRC的粪便DNA检测到基因突变[5]，有研究认为[6]，无创性基因检测筛查CRC是具有远大前景的筛查方法，Hsieh等[7]认为粪便DNA突变的检测对结直肠癌的临床病理特征和预后有一定影响，粪便DNA检测CRC的基因突现已成为无创性检测结直肠肿瘤的研究热点。本研究采用PCR-SSCP银染法联合检测与结直肠肿瘤发生较密切的APC、p53和K-ras基因，探讨粪便DNA检测在结直肠肿瘤中的应用价值。

APC基因是公认的结直肠癌管家基因，Abdul Murad等[8]应用PCR-SSCP法检测发现APC基因的突变率为35.89%；李琛等[9]应用高分辨熔解曲线法检测CRC中APC的突变率为41.90%，CRA中为25.00%。综合上述文献可知，APC基因在CRC中的突变率为36.1%～62.2%，CRA的突变率为20.0%～25.0%。本研究中APC在CRC组的突变率为21.4%，低于上述文献报道[8-9]，可能原因为APC突变与CRC的临床分期有关，因各个研究所选标本的Dukes分期不尽相同而结果有所差异。

p53基因是目前发现人类肿瘤相关性最强的抑癌基因，在进展性腺瘤发展成腺癌的过程中，p53基因发挥关键作用，主要发生在CRC的晚期阶段[5]。李琛等[9]检测到CRC p53的突变率为54.80%，CRA p53的突变率为46.40%；Bazan等[10]用PCR-SSCP法检测p53基因在CRC组中的突变率为43.00%。综上可知，p53基因在CRC中的突变率为43.00%～54.80%，在CRA的突变率在0%～46.40%。本研究中p53基因在CRC组的基因突变率为50.0%，CRA组为23.3%，与以上报道相符合[9-10]。

K-ras基因是原癌基因，主要发生在肿瘤的早期。Sidransky等[5]首次在9例结直肠肿瘤粪便中检测出8例K-ras基因突变，突变率为88.89%；李琛等[9]研究发现，CRC组 K-ras的基因突变率为35.50%，CRA组为14.30%；Bazan等[10]检测K-ras基因在CRC组中的突变率为46.00%。综上可知，K-ras基因在CRC组中的突变率为35.50%～88.89%，CRA组约14.30%。本研究中K-ras 在CRC组的基因突变率为42.9%，CRA组为16.7%，与上述文献报道相符合[9-10]，进一步证明了K-ras基因检测可用于筛查结直肠肿瘤，粪便DNA检测结直肠肿瘤具有良好的应用价值。

本研究结果还显示，APC、p53、K-ras三个基因联合检测在CRC组的突变率为57.1%、CRA组为30.0%，粪便DNA联合检测结直肠肿瘤的灵敏度为35.1%，与Imperiale 等[11]报道粪便DNA联合检测对筛查结直肠癌具有较高的灵敏度和特异度一致，可能是更适合于结直肠肿瘤筛查的无创性方法。

PCR-SSCP银染法检测基因突变具有快捷、灵敏度高、特异性高等优点，它能检测癌标本中微小的变异，检测大量标本时可用SSCP先筛选出异常基因，适用于大样本的筛查，Abdul Murad 等[8]应用PCR-SSCP筛查结直肠肿瘤，发现可降低结直肠肿瘤的病死率。Jin等[12]利用PCR-SSCP检测粪便DNA，在结肠镜检测正常的患者中未发现有基因突变，而在腺瘤中K-ras的突变率为10%，在CRC组的突变率为11.2%，与组织DNA的检测突变率是一致的。因此，PCR-SSCP 联合检测APC、p53、K-ras，操作可行性强，敏感性、特异性高，可为粪便DNA检测在结直肠肿瘤筛查中的应用开辟新的途径。

参考文献

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[12]Jin YM,Li BJ,Qu B,etal.BRAF,K-ras and BAT26 mutations in colorectal polyps and stool[J].World J Gastroenterol,2006,12(32):5148-5152.

The Value of APC,p53,K-ras DNA Detection in Colorectal Cancer Screening StudyXIAODan,ZHONGXuan-fang,XUAn-gao.(DepartmentofGastroenterology,HuizhouFirstPeople′sHospital,Huizhou516001,China)

Abstract：ObjectiveTo detect the sensitivity and specificity of gene adenomatous polyposis (APC),p53,K-ras genetic mutations in colorectal neoplasm using the ploymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism(PCR-SSCP) silver staining.MethodsSamples were enrolled from individuals who came to Huizhou First People′s Hospital Gastroenterology Clinic from Nov.2011 to Aug.2012:14 cases of colorectal cancer(CRC group),60 cases of colorectal adenomas(CRA group),30 cases of normal stool specimens,DNA was extrated,PCR-SSCP silver staining was used to detect genetic mutations.ResultsThe mutation rates of three genes APC,p53,K-ras detection in CRC,CRA and normal group were 57.1%(8/14),30.0%(18/60) and 3.3%(1/30) respectively.The sensitivity and specificity of three genes detection colorectal neoplasm were 35.1%(26/74)and 96.7%(29/30).The detection rate of three genes in CRC and CRA group were significantly higher than normal group(allP<0.05).ConclusionStool DNA detection is a feasibile non-invasive method for screening colorectal neoplasm,which might be a suitable non-invasive method for screening colorectal neoplasia.

Key words:Colorectal neoplasm; Stool DNA; Ploymerase chain reaction-single-strand conformational polymorphism; Adenomatous polyposis; p53; K-ras

收稿日期：2014-08-18修回日期：2015-05-10编辑：伊姗

基金项目：广东省医学科研究课题(B2011340)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.044

中图分类号：R574.6

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)21-3969-03