血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞活性氧和线粒体功能的影响

张慧锋，张 铎，王 婧，牛佳丽，陈陶陶，李 妍 (吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞活性氧和线粒体功能的影响

张慧锋，张 铎，王 婧，牛佳丽，陈陶陶，李 妍*(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

目的 分析血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人血管内皮细胞和猪血管内皮细胞的活性氧和线粒体功能的影响。方法 体外培养血管内皮细胞ECV-304和PAE，用不同浓度AngⅡ处理细胞，采用流式细胞术分析细胞内活性氧、线粒体膜电位和细胞凋亡。结果 血管内皮细胞内的ROS水平随AngⅡ浓度增加而增加，AngⅡ导致线粒体功能损伤和凋亡。结论 血管紧张素以浓度依赖的方式导致内皮细胞活性氧水平增加，并参与血管内皮细胞的损伤。

血管内皮;活性氧;线粒体;血管紧张素Ⅱ

血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统中重要的效应因子，与其受体结合可促进血管平滑肌收缩，参与血压调节［1］。临床研究表明，血液中AngⅡ或血管紧张素转化酶水平升高，是导致心肌梗死和动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)等疾病的危险因素。有学者报道，高浓度的AngⅡ可导致血管内皮细胞损伤［2］。了解AngⅡ介导内皮细胞损伤的机制，有助于研究保护血管内皮，预防相关疾病。本研究以人血管内皮ECV-304细胞和猪血管内皮细胞PAE为模型，研究不同浓度AngⅡ对内皮细胞的影响。

1 材料与方法

1．1 材 料

人血管内皮ECV-304细胞和猪血管内皮细胞PAE保存于液氮中。活性氧(reactive oxygen species，ROS)荧光探针双氯荧光黄乙酸乙酯(DCFH-DA)和线粒体膜电位探针Rh123购自上海碧云天生物技术研究所;1640培养液购自Gibco公司;小牛血清购自Hyclone公司;胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品;GFP-Annexin-V细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1．2 细胞培养与处理

复苏ECV-304细胞和PAE细胞，在如下条件下培养:含10%小牛血清1640培养液、5%CO2、饱和湿度和37℃。每周传代2～3次，取对数生长期细胞用于实验。接种细胞于培养瓶，加AngⅡ至不同浓度(0、50、100、200 和400 μg/mL)，继续培养 24 h 后收集细胞，完成后续实验。

1．3 细胞内活性氧检测

取106个细胞，PBS洗2次后，用 PBS洗2次，100μL PBS重悬细胞，加入DCFH-DA溶液1μL，混匀后在37℃避光反应30 min，PBS洗2次后用流式细胞仪分析。

1．4 线粒体功能检测

取5×105个细胞，用PBS洗2次，100μL PBS重悬细胞，加入 Rh123储存液 1μL，37℃避光孵育30 min。加入PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5min，弃去上清液。再加入PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，吸取残余液体。加入450μL PBS，混匀。300目尼龙筛网过滤，上机检测。

1．5 细胞凋亡检测

每组取5×105个细胞，PBS洗涤2次，95μL结合缓冲液重悬细胞，加入5μL Annexin-V-GFP工作液，室温下避光反应30 min;结合缓冲液洗涤细胞2次，400μL结合缓冲液重悬细胞，流式细胞仪分析。

2 结果

2．1 AngⅡ促进血管内皮细胞活性氧的产生

荧光探针DCFH-DA进入细胞后被酯酶水解为DCFH，继而被氧自由基氧化而生成DCF，检测DCF发射荧光的强度值可代表细胞内ROS水平，研究发现，ECV-304和PAE细胞内ROS的水平均随AngⅡ浓度增加而增加(表1)。

2．2 AngⅡ导致内皮细胞线粒体膜电位下降

荧光探针Rh123是一种线粒体跨膜电位的指示剂，与细胞内线粒体的结合，和线粒体膜电位密切相关，当线粒体膜电位下降时，Rh123结合弱。在Rh123探针染色后，流式细胞术分析线粒体功能。结果表明，ECV-304和PAE细胞内的线粒体膜电位随AngⅡ浓度增加而下降(表2)。

2．3 AngⅡ导致内皮细胞凋亡

Annexin-V-GFP是一种标记了GFP的Ga2+依赖性磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)结合蛋白，可结合细胞凋亡早期从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面的PS，检测细胞膜结合Annexin-V-GFP的细胞百分率可代表凋亡细胞。结果表明，ECV-304和PAE在AngⅡ诱导下，随其浓度增加凋亡细胞百分率增加(表3)。

表1 AngⅡ促进血管内皮细胞活性氧的产生

表2 AngⅡ导致内皮细胞线粒体膜电位下降

表3 AngⅡ诱导血管内皮细胞凋亡

3 讨论

肾素-血管紧张素-醛固酮系统在调节血压方面起着主要的作用，这种作用主要通过血管紧张素来实现的。AngⅡ能够升高血压，但对血管内皮有损伤作用。本研究结果表明，AngⅡ以浓度依赖的方式诱导人或其他动物血管内皮细胞凋亡;而细胞内活性含量也呈增加趋势。ROS是细胞内代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称，包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、一氧化氮。线粒体是细胞内产生ROS的重要细胞器，一定量的ROS即是细胞凋谢的必然产物，但ROS可活化c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)等信号通路［3］。JNKs又叫应激激活蛋白激酶，属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中JNK1广泛表达于各组织。近年发现，过量ROS可通过JNK1途径活化细胞内凋亡途径;而AngⅡ可导致细胞内ROS增加和线粒体膜电位下降，ROS参与AngⅡ导致的血管内皮细胞凋亡。与体外培养细胞体系比较，体内的血管内皮还可能受到内环境中多种激素、免疫分子和病原微生物成分的影响，多种因素将与AngⅡ共同影响血管内皮细胞的生物学特性。近年来，微炎症(microinflammation)的概念引起人们重视，微炎症是指以循环系统中炎性蛋白、炎症性细胞因子轻度升高为特征的低强度、慢性炎症状态［4］。单纯微炎症没有明显临床症状，但常伴随糖尿病、慢性肾病和长期血液透析患者存在［5］。导致微炎症的机制尚未明确，但AngⅡ可能发挥重要作用。因此，阐明AngⅡ对血管内皮细胞损伤的机制，对进一步了解血管相关疾病的机制，制定预防和治疗策略具有重要意义。

［1］刘铭，王志禄．肾素-血管紧张素-醛固酮系统及其受体与心血管疾病［J］．中华心血管病杂志，2002，30(3):190-192．

［2］关爱丽，牛玉宏，张国平，等．血管紧张素Ⅱ引起心肌微血管内皮细胞功能障碍及其可能机制的研究［J］．中国分子心脏病学杂志，2009，9(1):1-6．

［3］刘乐江，唐圣松．ROS介导JNK信号通路的研究进展［J］．现代生物医学进展，2010，10(7):1378-1380．

［4］Schilling JD，Machkovech HM，He Li，et al．TLR4 activation under lipotoxic conditions leads to synergistic macrophage cell death through a TRIF-dependent pathway［J］．J Immunol，2013，190(3):1285-1296．

［5］张伟，蒋耀光，谢志坚，等．严重胸部创伤复合内毒素感染对肺泡与肺间质巨噬细胞吞噬功能的影响［J］．中国危重病急救医学，2003，15(7):408-410．

Effect of angiotensinⅡon reactive oxygen species and m itochondrial function in vascular endothelial cells

ZHANG Huifeng，ZHANG Duo，WANG Jing，NIU Jiali，CHEN Taotao，LIYan*(College of Pharmacy，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

Objective To investigate the effect of AngiotensinⅡ(AngⅡ)on reactive oxygen species and mitochondrial function in Human vascular endothelial cells and pig vascular endothelial cells．Methods After ECV-304 and PAE cellswere treated with different concentrations of AngⅡ for different durations，reactive oxygen species，mitochondrialmembrane potential and cell apoptosiswere detected by flow cytometry．Results AngⅡ induced apoptosis of ECV-304 and PAE cells．Treatmentwith AngⅡreduced cellmembrane potential．Moreover，AngⅡtreatment significantly increased the level of reactive oxygen species in ECV-304 and PAE cells．Conclusion AngⅡsignificantly induces apoptosis of vascular endothelial cells possibly by increasing the reactive oxygen species level．

vascular endothelial cells;reactive oxygen species;mitochondria;AngⅡ

R541．6

A

1673-2995(2015)04-0241-03

国家自然科学基金项目(82102953);吉林省科技厅中青年科技创新领军人才及团队项目(20130521018JH);吉林省卫生厅项目(2012Z076);吉林省教育厅项目(2012423)．

张慧锋(1980-)，女(汉族)，讲师，博士．

李 妍(1972-)，女(汉族)，教授，博士．

10.13845/j.cnki.issn1673-2995.2015.04.001

2014-09-24)