春石斛试管花芽分化与开花的影响因素

董璐 李青

(北京林业大学，北京，100083)

责任编辑:任 俐。

春石斛为兰科石斛属植物，在南方或北方温室内早春开花，其园艺栽培品种花色艳丽、观赏期长，具有较高的观赏价值，但由于花期受限，目前只在年宵时畅销［1］。近年有关春石斛组织培养的研究方向主要集中在组培快繁体系的建立以及离体培养条件的优化［1－8］上，少有试管开花报道［2，9－10］。根据春石斛的市场销售现状，研究如何丰富其反季节产品种类对提高春石斛销售额具有实际意义。本试验针对开发春石斛试管花卉，研究不同因素对春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)试管花芽分化的影响，以期筛选出诱导较高试管花芽分化率的培养基配方，探索出一种较为稳定的离体成花体系，能人为控制开花时间，摆脱季节对其花期的限制，缩短开花周期，为探索石斛花芽分化、开花机制提供依据。

1 材料与方法

以组织培养获得的、经丛生芽途径继代5次、苗高为1．6～1．8 cm的春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)无菌试管苗为试验材料。

不同细胞分裂素、生长素种类及质量浓度配比对春石斛试管开花的影响:选择两种细胞分裂素，即6－BA(6－苄氨基嘌呤)、TDZ(噻苯隆)，各设置3个质量浓度水平(表1)，分别与各设置2个质量浓度水平(表1)的两种生长素，即NAA(萘乙酸)、2，4－D(2，4－二氯苯氧乙酸)，两两配比，同时附加1．0 mg·L－1PP333(多效唑)，进行完全随机区组试验。以不添加PP333的MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1的培养基作对照。培养120d后统计试管内花芽分化率及正常开花率。

不同无机盐质量分数对春石斛试管内花芽分化的影响:各处理培养基中附加0．2 mg·L－1TDZ、0．1 mg·L－1NAA，以及1．0 mg·L－1PP333。以MS作对照，通过对MS基本培养基中大量元素减半、或改变KNO3与KH2PO4的质量分数，研究不同无机盐质量分数对春石斛试管内花芽分化的影响。培养90 d后统计试管内花芽分化率。

表1 细胞分裂素与生长素质量浓度水平设计 mg·L－1

不同培养温度对春石斛试管内花芽分化的影响:设置培养温度分别为A．恒温为10℃条件下培养30 d后，再转至23℃条件下继续培养;B．恒温为23℃;C．昼/夜温度为23℃/10℃。将无菌苗接种在MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1+PP3331．0 mg·L－1的培养基上，在上述条件下培养120 d，定期统计试管内花芽分化率。

不同茎节数对春石斛试管内花芽分化的影响:将茎节数分别为0、1、2、3的试管苗，转接到改良1/2MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1+PP3331．0 mg·L－1培养基上，在恒温为10℃条件下培养30 d后，转为恒温23℃条件下培养60 d，统计试管内花芽分化率。

不同茎粗对春石斛试管内花芽分化的影响:将茎节数为3、茎粗分别为3、4、5、6、7 mm的试管苗转接到改良1/2MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1+PP3331．0 mg·L－1的培养基上，在恒温为10℃条件下培养30 d后，转为恒温23℃条件下培养60 d，统计试管内花芽分化率。

培养条件:光照强度2 000 lx，光照时间14 h·d－1。培养基中其他成分为3．0%蔗糖、0．6%琼脂，pH值为5．6。

数据统计:花芽分化率=(花芽数/总试管苗数)×100%;正常开花率=(正常开花数/总花芽分化数)×100%。每个处理接10个培养瓶，每瓶接种3株试管苗，重复3次。用SPSS软件对数据进行方差分析，用LSD法进行多重比较，检验各影响因素的差异显著性(P≤0．05)。

2 结果与分析

2．1 不同细胞分裂素、生长素种类及质量浓度配比对春石斛试管开花的影响

植物的离体培养中，外源激素的调控对器官的形成、生长极为重要，尤其细胞分裂素在离体花的形成过程中起十分重要的作用。将生长健壮、苗高一致的无菌苗接种到附加有不同细胞分裂素、生长素种类及质量浓度配比组合的培养基上，培养120 d统计试管内花芽分化率及正常开花率(表2)。

表2 不同细胞分裂素、生长素种类及质量浓度配比对春石斛试管开花的影响

培养120 d的结果显示，细胞分裂素与生长素相比，其为春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)花芽分化的主导影响因素，不同细胞分裂素种类对诱导其花芽分化影响差异显著。在附加有PP333的条件下，不同质量浓度6－BA与任一生长素(NAA或2，4－D)配比组合，几乎无花芽分化，仅诱导出腋芽与丛生芽，且增殖出的新芽茎基部膨大(图1A)。培养基MS+6－BA3．0 mg·L－1+2，4－D0．1 mg·L－1+PP3331．0 mg·L－1上的植株虽在培养过程中出现花芽分化，但花芽分化率极低，仅为0．59%，且花芽畸形，花瓣叶型(图1B)不能正常开放。而对应条件下，不同质量浓度TDZ与任一生长素(NAA或2，4－D)配比组合，均有花芽分化;在TDZ质量浓度相同的条件下，附加NAA配比组合的花芽分化率均高于附加2，4－D配比组合的花芽分化率。单独对TDZ作花芽分化率的多重比较，发现不同质量浓度TDZ对花芽分化率影响差异不显著，但整体花芽分化率随TDZ质量浓度的升高，呈现先升高后降低的趋势，以0．2 mg·L－1TDZ作用下花芽分化率最高。当TDZ质量浓度固定时，低质量浓度(即0．1 mg·L－1)生长素作用下的花芽分化率显著高于高质量浓度(即0．2 mg·L－1)生长素作用下的花芽分化率。即当TDZ的质量浓度为0．2 mg·L－1时，以添加生长素NAA0．1 mg·L－1诱导春石斛试管内花芽分化率最高，为36．91%，显著高于其他组合的花芽分化率。对TDZ作正常开花率的多重比较，发现不同质量浓度TDZ对正常开花率影响差异显著，0．1～0．2 mg·L－1TDZ作用下的正常开花率显著高于0．5 mg·L－1TDZ作用下的正常开花率。培养基MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1+PP3330．1 mg·L－1中，试管内花芽几乎全部正常开放(图1C);当TDZ质量浓度增加到0．5 mg·L－1时，正常开花率显著降低，出现花梗短缩(图1D)、花瓣呈绿色(图1E)、花上成花(图1F)等畸形现象。对照组MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1试管内无花芽分化现象。综合考虑，在添加有PP333的条件下，2．0 mg·L－1TDZ与0．1 mg·L－1NAA为适宜的细胞分裂素、生长素种类及质量浓度配比组合，能有效诱导春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)试管开花。

图1 春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)的试管开花

2．2 不同无机盐质量分数对春石斛试管内花芽分化的影响

将生长一致的无菌苗接种到含有不同无机盐质量分数的培养基中，培养90 d后比较试管内花芽分化的情况(表3)。对表3进行方差分析，将花芽分化率进行两两比较，不同无机盐质量分数对诱导春石斛花芽分化影响差异显著。3号改良培养基(即MS大量元素中除KNO3与KH2PO4外，其他无机盐质量分数减半)与4号改良培养基(即MS大量元素中KNO3与KH2PO4质量分数加倍)上培养的试管苗花芽分化率显著高于其他培养基，分别为52．18%与51．61%，且长势较好，茎基部有少量黄叶现象;2号培养基(即MS大量元素无机盐质量分数均减半)由于培养基中大量元素的减少，未对植株提供充足的营养物质，从而影响了植株的长势与成花，所培养的试管苗花芽分化率最低，仅为30．74%;对照MS培养基上培养的植株虽长势好，但花芽分化率显著低于3、4号改良培养基，为37．31%。从结果中发现，增加P、K的质量分数比例，能有效促进花芽的形成，花芽分化率显著增加，P、K质量分数为其他大量元素质量分数的2倍时，春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)的花芽分化率最高。

表3 不同无机盐质量分数对春石斛花芽分化的影响

2．3 不同培养温度对春石斛试管内花芽分化的影响

自然条件下，春石斛早春开花，低温春化作用是诱导其花芽分化的有效因素。将长势一致、苗高为1．6～1．8 cm的试管苗转接到MS+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1+PP3331．0 mg·L－1培养基中，在3种培养温度条件下进行培养。通过不同培养周期观察并记录花芽分化率，花芽分化率随培养周期的增长而升高，相同培养周期内的3种培养温度条件下的花芽分化率两两比较，均差异显著(表4)。60 d时发现在A培养条件(恒温为10℃下培养30 d后，转至恒温为23℃)下培养的试管苗，与在C培养条件(昼温/夜温为23℃/10℃)下培养的试管苗开始有花芽分化，此时花芽分化率较低，分别为7．69%与13．46%，而在B培养条件(恒温为23℃)下培养的试管苗无花芽分化;培养至75 d时，A培养条件下的试管苗花芽分化率为33．96%，显著高于C培养条件下30．77%的花芽分化率，B条件下培养的试管苗仍无花芽分化。培养至90 d时，在A培养条件与C培养条件下培养的试管苗花芽分化率分别增加到41．51%、37．74%，此后30 d内，花芽分化的增加速度有所减缓，在120 d时，A培养条件下的试管苗花芽分化率趋于稳定，为43．40%，与C培养条件下的花芽分化率(42．83%)差异不显著。而在B培养条件下培养的试管苗，培养至90 d时，才开始有花芽分化，花芽分化率为8．57%;培养至120 d时，花芽分化率增加到36．59%，但仍显著低于A、C培养条件下的花芽分化率。试验说明春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)对低温春化要求并非绝对的，其在23℃的恒温条件下培养120 d能诱导出较高的花芽分化率;而相比于常温恒温，低温或昼夜温差处理能使植株提前30 d开花，花芽分化率明显增加。根据试验结果，筛选出恒温10℃下培养30 d，转至恒温23℃继续培养60 d，为诱导春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)试管花芽分化的适宜培养条件，使其能在较短时间内诱导出较高的花芽分化率。

表4 不同培养温度对春石斛花芽分化的影响

2．4 植株不同茎节数对春石斛试管内花芽分化的影响

试管苗的茎节数对试管内花芽诱导影响显著。将不同茎节数的无菌苗接种到1/2MS(50%KNO3+50%KH2PO4)+TDZ0．2 mg·L－1+NAA0．1 mg·L－1+PP3331．0 mg·L－1培养基上，在上述试验筛选出的培养条件下培养90 d，结果表明，茎节数少于2个的三植株无花芽分化现象;而茎节数为2或3的植株有花芽分化，且花芽分化率较高，分别为50．65%与52．11%。由此可见，春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)植株的茎节数影响花芽分化，2个茎节是其营养生长向生殖生长转化的临界条件。

2．5 不同茎粗对春石斛试管内花芽分化的影响

植株的茎粗对试管内成花数量影响显著(表5)，花朵数量随茎粗度增加而呈上升趋势，两两比较，差异显著;花芽分化率也随茎粗的增加呈上升趋势。茎粗为7 mm的试管苗成花数量显著高于其他茎粗植株的成花数量，为3．31朵，此时花芽分化率也最高，为56．92%。由此可推测，植株茎粗直接影响植株体内营养物质存贮状况，茎粗越粗，存贮营养越多，花芽分化时能供应的营养越多，此时花芽分化率增加，花朵数量增多。

表5 不同茎粗对春石斛花芽分化的影响

3 结论与讨论

植物花芽分化和开花是一个受内部因素和外部环境共同调控的十分复杂的生理过程，植物开花受如光照、温度、水分、肥料等外界环境条件及内部如植物年龄、激素平衡等状况及其相互间的作用的影响［11－12］。要诱导植物在离体条件下花芽分化并正常开花，既要考虑植物生长调节物质、培养基成分等条件对植物体内激素的调控，又需要研究培养环境对其营养、生殖生长的影响。

不同细胞分裂素种类对诱导春石斛花芽分化影响有差异。6－BA与1．0 mg·L－1PP333的组合，与生长素配比不能诱导花芽分化;而TDZ表现出很高的细胞分裂素活性［13］，附加有不同质量浓度TDZ与1．0 mg·L－1PP333的组合，在与不同质量浓度NAA、2，4－D配比试验中，均有花芽分化，其中添加1．0 mg·L－1PP333、0．2 mg·L－1TDZ与0．1 mg·L－1NAA配比时，春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)的花芽分化率最高，且全部开放正常。花芽分化率随TDZ质量浓度的升高，呈现先升高后降低的趋势;激素质量浓度过高可能导致畸形花或者花芽不能正常开放，这与李璐［14］研究石斛兰开花机制的结果相一致。自然条件下，在已知五大类植物激素中，赤霉素对开花的影响最大［15］，在后续的研究中，可进一步研究赤霉素在离体条件下对春石斛开花的影响。

大量元素在植物生长过程中起着重要作用。许多离体开花诱导研究发现，培养基中低质量分数的氮有利于促进开花，而较高质量分数的N抑制开花［16－23］;改变P元素的质量分数可影响甚至提高花芽分化率［24－25］;通过调整基本培养基中N、P、K比例，可以促进金钗石斛与细茎石斛试管开花［26－27］;提高P离子质量分数、降低N离子质量分数，对开花有利［28］;也有研究发现，P、K质量分数的减半可增加成花数量［29－30］。本试验以未改变成分的MS基本培养基作为对照，发现增加KNO3与KH2PO4在大量元素中的相对质量分数，间接降低N质量分数，改变N、P、K比例，能有效促进花芽的形成，显著增加了春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)的花芽分化率。

花的发生和花芽的分化都需要一定的温度，温度对于植物成花的影响是多方面的。因种间差异，不同植物的成花有各自一定范围的温度需求［31］。一些植物需要低温春化作用才能促进成花［22－23，30，32］，一些植物需要高温热激处理诱导花芽分化，一些植物对昼夜温差有一定的要求，也有许多属(Arethusa，Calypso，Cymbidium，Dendrobium，Oncidium，Sarcochilus)包括一些具有温周期的植物，通过持续培养在高温，即无低温的诱导作用即可成花［10－33］。本试验在恒高温、恒低温以及昼夜温差3种培养温度条件下，验证了无低温诱导，春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)也能成花，且得出相较于常温恒温、低温或昼夜温差处理能提前开花，且开花率显著增加的结果。

植物由营养生长转变为生殖生长，前期需要积累一定的营养物质，苗高等生理指标代表植株体内营养物质存贮状况，对试管内花芽诱导有较大影响［6－7，14，16］。本 试 验 对 春 石 斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)的茎节数与茎粗两个生理指标进行研究，发现茎节数对花芽分化影响显著，具2个茎节是其营养生长向生殖生长转化的临界条件。而茎粗则直接影响试管内成花数量，茎粗越粗，花朵数量越增加。关于成花数量的报道还有发现低质量浓度TDZ诱导的花芽多为顶生单花，高质量浓度TDZ诱导的花芽多为总状花序［34］。

在所研究的影响因素中，春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)自身芽体的营养生长状态是其花芽分化的基础前提条件，即试管苗本身必须存贮足够的营养物质，才能完成由营养生长向生殖生长的转变;否则即使提供适宜的培养基及培养条件，也无法诱导其花芽分化;其次激素种类及质量浓度的配比是关键因素，尤其细胞分裂素的种类对于春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)花芽分化是否能分化作用极为显著;无机盐质量分数与培养条件对花芽分化率影响显著，适宜的无机盐质量分数与适宜的培养条件可有效提高花芽分化率，但并非诱导春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)由营养生长向生殖生长的充要条件。培养基成分中还有其他种类外源激素、不同碳源、蔗糖浓度、琼脂浓度等因素也有可能影响春石斛(Dendrobium nobile‘Huoniao’)花芽分化，在后续的试验中，可以进一步探索其他因素对其试管开花的影响。

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