高效液相色谱法测定血中伊立替康及活性代谢物SN-38浓度

鞠晓宇，罗雪梅，葛卫红，王友群*中国药科大学，南京 0009；南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 0008

高效液相色谱法测定血中伊立替康及活性代谢物SN-38浓度

鞠晓宇1，罗雪梅2，葛卫红2，王友群1*
1中国药科大学，南京 210009；2南京大学医学院附属鼓楼医院，南京 210008

目的：建立高效液相色谱法同时测定结直肠癌患者血中的伊立替康（CPT-11）及其活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）的浓度，并对我院基因型指导给药方案进行评价。方法：以2 μg·mL-110-羟基喜树碱作为内标，先用100 μL 10%高氯酸沉淀蛋白，再用50 μL 10%高氯酸酸化血浆。采用Agilent ZORBAX Eclipse C8色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）对CPT-11和SN-38进行分离；以0.05 mol·L-1的磷酸二氢钠-乙腈-三乙胺（75∶25∶0.1，v∶v，磷酸调pH 3.0）为流动相；荧光检测波长：激发波长380 nm，发射波长550 nm。结果：人血浆中CPT-11和SN-38线性范围均为3~1000 ng·mL-1，定量下限为3 ng·mL-1；准确度分别是98.5%和100.0%；回收率分别是83.8%和84.3%。结论：本方法可靠、简便、快速，可为伊立替康个体化给药提供参考。

伊立替康；SN-38；血药浓度；高效液相色谱；荧光检测

伊立替康（irinotecan，CPT-11）是一种水溶性喜树碱衍生物，能通过干扰DNA复制和转录，产生细胞毒效应[1]。临床上，伊立替康与5-氟尿嘧啶和亚叶酸联合治疗既往未接受化疗的晚期结直肠癌。

伊立替康在体内主要经羧酸酯酶代谢成活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）。SN-38通过肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）的糖基化作用，灭活成无活性的葡萄糖醛酸化SN-38（SN-38G）而排出[1]。SN-38G可在肠道细菌β-葡萄糖醛酸酶作用下转换为SN-38，引发肠黏膜损伤及迟发性腹泻[2]。SN-38作为伊立替康的活性代谢产物，又是产生严重不良反应的诱导因素，因此建立一套同时测定伊立替康和SN-38的方法显得尤为重要。目前主要的检测手段多为高效液相色谱法（HPLC）联用质谱法（MS），成本较高，不适宜临床大规模推广。本实验以10-羟基喜树碱作为内标，建立结直肠癌患者血中伊立替康及SN-38的HPLC法联合荧光检测分析方法，旨在为伊立替康个体化治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液色谱仪（美国Agilent公司，包括四元高压泵，在线脱气机，手动进样器，柱温箱，FLD荧光检测器和1100 Agilent色谱工作站）；AUW220D型电子天平（日本岛津公司）。

1.2 药物与试剂

伊立替康对照品（批号100767-201303，中国食品药品检定研究院）；SN-38对照品（批号LR30O14，北京百灵威科技有限公司）；10-羟基喜树碱（内标，批号20090701，黄石李时珍药业集团武汉李时珍药业有限公司）。乙腈为色谱纯；磷酸二氢钠、三乙胺、高氯酸均为分析纯；水为纯净水。

1.3 受试者基因检测

受试者为我院肿瘤科住院患者，诊断为结直肠癌。治疗过程中，按照美国食品和药品监督管理局（FDA）的建议，受试者在接受伊立替康化疗前进行UGT1A1*28基因型检测。采集2 mL患者全血于EDTA抗凝管，采用PHARM-GENE 200 SNP分析样品处理试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司）处理，严格按照说明书操作分批次统一提取，采用荧光检测仪（西安天隆科技有限公司）测定，读取基因型。UGT1A1基因型分为6/6型（野生型）、6/7型（突变杂合子型）和7/7型（突变纯合子型）。结合患者基因型及病情进行首剂量给药，以减少不良反应。

首剂量给药后，于化疗结束后0 h、24 h各取3 mL静脉血，置于EDTA抗凝取血管中，离心分离出血浆，所有测试样品均保存于-20℃冰箱中待用。

2 方 法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse C8（4．6 mm× 150 mm，5 μm）（Agilent）；流动相：0．05 mol·L-1磷酸二氢钠-乙腈-三乙胺 （75∶25∶0．1，v∶v，磷酸调pH 3．0）；荧光激发波长380 nm，发射波长550 nm；柱温：23℃；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取CPT-11和SN-38对照品5．5 mg和4．7 mg，用二甲亚砜溶解并定容至10 mL量瓶中，配制成0．55 mg·mL-1和0．47 mg· mL-1的标准贮备液。精密量取标准贮备液适量，再用乙腈-水-甲酸（50∶50∶0．1）稀释液分别逐步稀释成含 CPT-11及 SN-38为20、6、2、0．6、0．2、0．06 μg· mL-1的标准工作液，置-20℃冰箱保存备用。

2.2.2 内标溶液 精密称取内标10-羟基喜树碱适量制成2 μg·mL-1的溶液，置-20℃冰箱保存备用。

2.3 血浆样品的制备

取血浆样品200 μL置于1．5 mL EP管中，加入2 μg·mL-1内标液10 μL，混匀，以100 μL 10%高氯酸为沉淀剂，12000 r·min-1离心3 min；取200 μL上清液，加入50μL 10%高氯酸酸化，混匀，20μL进样。

3 结 果

3.1 方法专属性考察

空白血浆、空白血浆加内标和标准品、受试者伊立替康注射后0 h、24 h血浆按“2．3”项下方法操作。由图1可见内标、CPT-11和SN-38的保留时间分别为4．2、5．7、7．8 min，血浆样品中内源性物质不干扰内标、CPT-11和SN-38的测定。

3.2 标准曲线制备

取健康人空白血浆180μL，加入CPT-11和SN-38系列浓度对照品溶液各10 μL，混匀，配制成相当于血药浓度为1000、300、100、30、10、3 ng·mL-1的对照品血浆。按“2．3”项下方法操作。以被测物峰面积与内标峰面积的比值（Ai/As）对血浆浓度（c）作线性回归，得CPT-11（Y1）和SN-38（Y2）标准曲线方程，分别为式（1）和式（2）。CPT-11和SN-38线性范围均为3～1000 ng·mL-1。定量下限为3 ng·mL-1。

3.3 精密度试验

分别制备CPT-11和SN-38浓度为800、80、8 ng·mL-1的对照品血浆，按“2．3”项下方法操作，同日和连续5 d各处理5份血浆，求得日内和日间精密度。结果见表1。低、中、高浓度时CPT-11和SN-38的精密度符合生物样品分析的要求。

图1 高效液相色谱图

3.4 回收率试验

配制并处理含CPT-11和SN-38浓度分别为800、80、8 ng·mL-1的标准含药血浆，每个浓度平行5份，按“2．3”项下依法操作，作为回收率样品；另取5个不同来源空白血浆同法处理，取上清液，加入CPT-11、SN-38和内标标准溶液，配制同上3个质量浓度的标准含药血浆，每个浓度平行5份，作为回收率对照样品。将上述样品进样，记录色谱图，回收率样品峰面积与相应对照品峰面积均值之比即为回收率值，结果见表l。低、中、高浓度时，CPT-11和SN-38的回收率符合生物样品分析的要求。

表1 方法精密度及回收率（n=5）

3.5 方法稳定性

分别考察CPT-11和SN-38浓度为800、80、8 ng·mL-1的对照品血浆稳定性：（1）3份立即处理并测定；（2）3份室温放置6h后处理测定；（3）3份反复冻融3次后处理测定；（4）3份于进样器放置8h测定。结果显示，（2）、（3）、（4）组相对于 （1）组CPT-11的相对含量均大于90．0%；SN-38的相对含量均大于89．0%。稳定性良好。

3.6 样品测定

6名患者（女2人，男4人，年龄49～53岁），均诊断为结直肠癌。6名受试者在接受伊立替康化疗前均接受UGT1A1*28位点的基因型检测，以结果指导患者首次给药剂量。6名受试者在伊立替康注射结束后0 h、24 h时采样，无遗漏。经测定，各患者伊立替康及SN-38血药浓度结果见表2。

4 讨 论

4.1 方法学评价

现有文献报道显示，血中CPT－11及其活性代谢产物SN－38的测定方法大多采用高效液相色谱法联用质谱法[3]或超高液相色谱法[4]。本文所建立的HPLC法，检测成本低，其检测仪器在医院较为普及。与同样采用荧光检测法检测的文献中方法相比[5]，本实验通过流动相组分优化及色谱柱的选择，在等度洗脱条件下使各组分达到了很好的分离度，且每针分析时间缩短至10 min以内。本方法特异性好，分离度高，血浆内源性物质无干扰。适用于医院临床样本的快速分析，以完成伊立替康的个体化给药的工作。

表2 6名受试者血药浓度测定结果（ng·mL-1）

4.2 系统适应性

实验分别对流动相的组成及比例进行了考察，当使用甲醇-磷酸二氢钠作为流动相时，虽然待测物能够分离，但系列溶液并不成线性。改用乙腈-磷酸二氢钠后，不仅改善峰形，且系列溶液呈良好的线性关系，但CPT-11和内标存在一定拖尾现象；加入0．1%的三乙胺后峰型有显著改善，见图2。

图2 高效液相色谱图

要注意的是，柱温的微小变化对待测物的保留时间也有一定影响，因此在实验过程中应该保持柱温恒定，保证实验的重现性。

4.3 样品的预处理

CPT－11及其活性代谢产物SN-38是pH依赖性，在体内保持内酯和羧酸盐两种形式的动态平衡，当pH在4～5时，是以内酯形式存在；而当pH为7．4时，是以羧酸盐形式占优势[3]。实验采用乙腈－水－0．01 mol·L-1甲酸（50∶50∶0．1，v∶v）来配制对照品溶液，不仅将CPT－11和SN－38都转化为内酯形式，便于准确的测定，同时增加了两者的稳定性。

在样品预处理时，有的文献采用了甲醇沉淀[6]、甲醇-乙腈沉淀并离心10 min[7]，而本实验采用了强酸沉淀法来去除血浆中的蛋白质，10%的高氯酸溶液可以将90%以上的蛋白质除去，还缩短了操作时间。在离心后的上清液中加入50 μL高氯酸酸化，也是为了保持其呈酸性，使内酯-羧酸盐平衡向内酯方向移动，确保测定的结果更加准确。

4.4 临床应用

本实验收纳6名患者，在伊立替康化疗前均接受UGT1A1*28基因位点检测，根据基因分型调整初始剂量[8]。其中因6/7型患者代谢能力较野生型6/6型慢[9]，6号患者的初始剂量减少为200 mg。经过血药浓度检测后，患者血药浓度控制较好，且未发生中性粒细胞减少和迟发性腹泻等不良反应。

4号患者虽为野生型，但曾于“XELOX”方案中出现2级骨髓抑制和1级肝功异常，被迫调整为“FOLFIRI”（双周模式）。由于患者肝功异常，为防止在化疗过程中出现不良反应，因此在初始剂量时调整给药剂量为200 mg。患者24 h的SN-38浓度较其他6/6型高，表明其代谢能力较正常人弱，但未发生迟发性腹泻，且血常规与生化指标在正常值范围内。建议在下个化疗疗程给药时可维持原剂量。

5号患者基因型虽为6/6型，但在过去的化疗过程中曾于 “羟基喜树碱”腹腔灌注化疗中出现2级消化道反应，1级骨髓抑制；曾于“艾力+希罗达”双周方案中出现1级骨髓抑制。故在本次化疗中将伊立替康剂量减少至100 mg。检测结果表明，患者伊立替康和SN-38血药浓度均正常，且中性粒细胞计数和胆红素均在正常值范围内。

5 总 结

UGT1A1是伊立替康代谢重要酶，该酶的基因多态性和药物相互作用，导致伊立替康的临床反应呈现明显个体差异。因此，在2005年，美国食品和药品监督管理局（FDA）在修订伊立替康药品说明书的同时，还要求伊立替康的包装上注明该药容易使UGT1A1*28基因突变纯合子患者发生中性粒细胞减少，并且推荐检测该基因型。近年来研究还发现，伊立替康及其代谢物的血药浓度与治疗后中性粒细胞减少百分比密切相关，即SN-38血药浓度越高，中性粒细胞减少百分比越大[8，10]。伊立替康引发的迟发性腹泻也与血液中的SN-38峰值浓度有关[11]。由此提示，在UGT1A1*28基因检测的基础上，结合患者具体病情，监测伊立替康及其代谢物SN-38的血药浓度，能够更好地制定安全有效的个体化给药方案，指导临床合理用药。

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Determination of Irinotecan and Its Active Metabolite SN-38 in Plasma by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Fluorescence Detection

JU Xiao-yu1,LUO Xue-mei2,GE Wei-hong2,WANG You-qun1
1China Pharmacetical University,Nanjing 210009,China;2Nanjing Drum Tower Hospital,the Affiliated Hos-pital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China

Objective:To determine irinotecan (CPT-11)and its active metabolite 7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin (SN-38)in plasma of patients with colorectal cancer by high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection and to evaluate the dosage regimen by genotype information.Methods:Irinotecan and metabolites were detected in plasma.The internal standard was 2 μg·mL-110-hydroxycamp-tothecin.Protein in plasma was precipitated with 10%perchloric acid before acidification with 10%perchloric acid.Separation of the compounds was achieved using an Agilent ZORBAX Eclipse C8(4.6mm×150mm,5μm) analytical column.The elution was performed with a mobile phase of 0.05mol·L-1sodium dihydrogen phosphate solution-acetonitrile (75∶25,v∶v)containing 0.1%triethylamine.The fluorescence detector excitation and emis-sion wavelengths were set at 380 and 550 nm,respectively.Results:The linear ranges for CPT-11 and SN-38 were 3-1000ng·mL-1.The limits of quantification of CPT-11 and SN-38 were 3ng·mL-1.The average accuracy of CPT-11 and SN-38 were 98.5%and 100.0%;the average recoveries were 83.8%and 84.3%.Conclusion:This method is reliable,convenient and efficient,which can provide reference for individualized drug administration.

Irinotecan;SN-38;Plasma concentration;HPLC;Fluorescence detector

R969.1

A

1673-7806（2015）03-267-04

鞠晓宇，女，硕士生 E-mail:juxiaoyu900418@163.com

*通讯作者王友群，男，副教授 E-mail:wyqfbox@163.com

2015-04-16

2015-05-11