脐带间质干细胞移植对Graves病小鼠调节性B细胞的影响＊

李荣良，韩扣兰，戴小丽，黄 诚，李卫勇

（盐城卫生职业技术学院临床医学院，江苏盐城224005）

毒性弥漫性甲状腺肿（Grave′s disease，GD）是以甲状腺的自身免疫为特点的多系统临床综合征，是甲亢的主要类型之一。GD 患者体内存在免疫应答调节受损，以致免疫应答反应过强而造成甲状腺细胞的自身免疫性损伤。脐带间质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）是一种具有向多向分化潜能的祖细胞，在体外能大量扩增，能着巢于受损组织。MSCs通过对T 细胞、B 细胞和树突状细胞（DC）等免疫活性细胞的调节发挥作用［1］。MSCs免疫原性较低，在异基因MSCs移植时未发现明显的排斥反应。MSCs在分化成其他细胞类型时仍保留其免疫调节作用［2］。目前，在临床上，MSCs已被广泛用于治疗移植物抗宿主病（GVHD）、系统性红斑狼疮（SLE）等自身性免疫病［3］。Choi等［4］最近研究发现脂肪来源的MSCs可以影响T 辅助（Th）细胞因子的平衡治疗甲状腺炎。作者先前研究表明，UC-MSCs治疗GD 小鼠安全有效［5］。本实验将通过比较UC-MSCs治疗GD 小鼠前、后脾脏Bregs表达量与对照小鼠有无差异，以及其与甲状腺刺激抗体（TSAb）水平是否存在相关性来初步探讨MSCs治疗GD 的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 基因扩增引物设计及合成 根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站GenBank 查询鼠甘油醛-3-磷酸脱氧酶（GAPDH）（上游引物：5′-AAG CCT GAC CAC GCT TTC TA-3′，下 游 引 物：5′-ATG AAG TGG TTG GGG AAT GA-3′）、白细胞介素-10（IL-10）（上游引物：5′-CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA-3′，下游引物：5′-TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG-3′）、转化生长因子-β（TGF-β）（上游引物：5′-TGC GCT TGC AGA GAT TAA AA-3′，下游引物：5′-CGT CAA AAG ACA GCC ACT CA-3′）mRNA 序列。以上引物的设计与合成由大连TaKaRa 公司利用Primer express 软件完成。

1.1.2 试剂与动物 36只6～8周龄雌性BALB／c小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），体质量（20.0±2.0）g。脐带标本来源于健康产妇正常分娩足月新生儿（来自于盐城市妇幼保健院产科），UC-MSCs分离、培养与鉴定所需的试剂同前期研究［6］。血清游离甲状腺素（FT4）检测试剂盒与TSAb检测酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒分别由美国DPC 与天津瑞爱金生物科技有限公司提供；PE-CD1d、FITC-CD5、PerCP-cyTM5.5-CD19共3种不同荧光标记抗鼠单克隆抗体均购自美国BD 公司；RNA 反转录试剂盒与SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒均来源于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 GD 模型小鼠的制备与分组 GD 模型小鼠（在江苏省医药动物实验中心SPF 级环境下饲养）的免疫方法与步骤同本课题组之前的研究［5］，在第3次免疫后21d（18周）测定移植前血清中FT4与TSAb的表达量，细针穿刺甲状腺组织苏木精-伊红（HE）切片染色。第19周分别随机选择3只GD 模型小鼠与1只正常对照小鼠处死，将剩余小鼠分成3组，即正常对照组（G0组，8只）、GD 对 照 组（G1 组，12 只）、UC-MSCs治疗组（G2组，12只）。第20周G1组与G2组分别于予0.5 mL生理盐水和l×106P3代UC-MSCs尾静脉注射1次，第26周处死所有小鼠，检测实验预先设计内容。

1.2.2 UC-MSCs收集和单个核细胞分离及培养、鉴定 同本课题组之前的研究方法［5］，将脐带从手术台上取下，将脐带剪碎后用胰酶消化成单个细胞，培养与传代至细胞融合，最后应用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面标志。

1.2.3 血清TSAb、FT4的测定 ELISA 法测定血清TSAb的浓度，FT4测定按试剂盒说明书操作。

1.2.4 组织鉴定 将甲状腺固定、包埋、切片与HE 染色，最后在光学显微镜下观察小鼠甲状腺滤泡结构等组织学变化。

1.2.5 调节性B细胞（Bregs）的检测 在小鼠脾脏单个核细胞悬液（1.0×106／mL）加入脂多糖（LPS）10μg／mL，在标准条件下培养24h后，加入PE-CD1d、FITC-CD5、PerCP-cyTM5.5-CD19共3种不同荧光标记抗鼠单克隆抗体，并做荧光染色对照，前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）联合设门流式检测小鼠脾脏CD1dhiCD5＋CD19＋细胞的表达量（图1）。

图1 流式细胞术检测CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs代表图

1.2.6 实时荧光定量PCR 分析 应用TRIzol-氯仿法试剂裂解、纯化抽提脾细胞总RNA，将总RNA 反转录为互补DNA（cDNA），再在ABI Prism7500型高通量荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystems公司）上进行实时荧光定量PCR。按2步法PCR 扩增标准程序将不同基因的标本做3个复孔。扩增条件为第1步（预变性），95 ℃10s1个循环；第2步（PCR 反应）95 ℃5s、60 ℃34s45个循环。最后以SDS2.0（PE Biosystem）软件分析其Ct值。计算各标本平均Ct值，以GAPDH作为内参，将IL-10、TGF-βCt值减去GAPDH Ct值作为△Ct值。计算标准化后的2-ΔΔCt值表示mRNA 的相对表达含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0软件将数据进行统计学处理，对各分组进行单因数方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 UC-MSCs移植对GD 小鼠血清FT4及TSAb的影响 移植后，G1组血清FT4与TSAb水平均显著高于G0组（P＜0.05）；G2组FT4与TSAb表达低于G1组，但FT4无显著差异，而TSAb差异明显（P＜0.05），见表1。

表1 移植后血清FT4、TSAb水平与脾脏CD19＋B细胞、CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs百分比（±s）

表1 移植后血清FT4、TSAb水平与脾脏CD19＋B细胞、CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs百分比（±s）

＊：P＜0.05，与G0组比较；△：P＜0.05，G0组比较。

组别 n FT4（pmol／L） TSAb（U／mL） CD19＋B细胞（%） CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs（%）G0组8 4.98±0.20 2.90±0.37 7.81±0.89 6.21±0.43 G1组 12 12.07±1.11＊ 5.73±0.65＊ 11.00±1.41＊ 4.16±0.67＊G2组 12 11.60±1.19 3.09±0.31△ 8.05±0.84△ 6.76±0.88△

图2 UC-MSCs移植后脾脏IL-10与TGF-β mRNA 的表达水平

2.2 UC-MSCs移植对GD模型鼠脾脏CD19＋B细胞与CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs表达影响移植后，G1组血清CD19＋B细胞百分比均显著高于G0组（P＜0.05），而CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs百分比却显著低于G0组（P＜0.05）；G2组CD19＋B细胞百分比明显低于G1 组（P＜0.05），但CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs百分比明显高于G1组（P＜0.05）。

2.3 UC-MSCs移植对GD 模型鼠脾脏组织IL-10与TGF-β mRNA 表达的影响 移植后，G1组脾脏IL-10与TGF-βmRNA 水平均显著低于G0组与G2组（P＜0.05），见图2。

2.4 TSAb与CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs在移植前、后表达水平变化的相关性 G2组GD 小鼠血清TSAb浓度差（治疗前-治疗后）与CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs水平变化（治疗前-治疗后）呈显著负相关（r＝-0.943，P＜0.01），与IL-10与TGFβmRNA 表达水平的△△Ct值（治疗前-治疗后）呈显著正相关（r＝0.800、0.768，P＜0.01），见图3。

图3 UC-MSCs移植前、后TSAb与CD1dhi CD5＋CD19＋Bregs表达的相关性

3 讨 论

促甲状腺素受体抗体（TRAb）是由B 淋巴细胞产生的一类具有异质性的特异性免疫球蛋白（IgG 类），其中，TSAb能够与促甲状腺激素受体结合，刺激甲状腺激素的合成和分泌，从而引起甲状腺功能亢进的表现。Bregs是新发现的B 细胞亚群之一，CD1dhiCD5＋CD19＋是目前国际上比较公认的Bregs表型［6］。研究发现，Bregs在炎性肠病、1型糖尿病、多发性硬化症等自身免疫病的发生、发展及转归过程中发挥重要作用［7-11］。UC-MSCs移植治疗GD 小鼠时发现，G2组GD 小鼠血清TSAb的水平较对照组明显下降，同时脾脏CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs的水平较对照组却明显上升，且二者的变化存在明显相关性。这说明UC-MSCs移植治疗GD 小鼠可能是通过上调CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs而发挥治疗作用。

在辅助性T 细胞诱导下GD 患者体内被激活的B细胞分泌大量的自身抗体，CD19 与B 细胞活化和信号转导密切相关［12］。有 研 究 表 明，IL-10、TGF-β是2 种 重 要 的 抑 制 性 细 胞因子，Bregs可通过其分泌发挥免疫调节作用［13］。通常把产生IL-10的具有CD1dhiCD5＋CD19＋表型的Bregs亚群称之为B10细胞，它们能特异地产生IL-10 并且是其主要B 细胞来源，而且它们可能只产生IL-10［14］。Hussain等［8］研究发现，给1型糖尿病的NOD 模型小鼠静脉输注经B 细胞抗原受体（BCR）激活的B细胞，可以通过其产生的IL-10使NOD 小鼠的胰岛炎性指标表达下降，延缓糖尿病的发生和发展。还有一种在体外可以被LPS 刺激活化而分泌TGF-β 的Bregs 细胞［15］。同样，在给患有结肠炎的SAMP1／Yit小鼠体内静脉输注经过LPS 刺激CD1d＋的B 细胞亚群，可以通过它产生TGF-β抑制免疫反应，减少炎性损伤［15］。

本研究发现，GD 小鼠脾脏IL-10mRNA 与TGF-βmRNA表达量较正常对照小鼠明显降低，但经过UC-MSCs移植治疗后其表达却明显上升。

综上所述，Bregs异常表达不仅与GD 发病密切相关，而且UC-MSCs可通过上调Bregs而产生IL-10、TGF-β，在治疗GD中介导免疫耐受，发挥免疫调节作用。

［1］ Aggarwal S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses［J］.Blood，2005，105（4）：1815-1822.

［2］ Le Blanc K，Rasmusson I，Sundberg B，et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells［J］.Lancet，2004，363（9419）：1439-1441.

［3］ 张华勇，冯学兵，马晓蕾，等.异基因骨髓间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮11例临床分析［J］.中华风湿病学杂志，2009，13（2）：89-92.

［4］ Choi EW，Shin IS，Lee HW，et al.Transplantation of CTLA4Ig gene-transduced adipose tissue-derived mesenchymal stem cells reduces inflammatory immune response and improves Th1／Th2balance in experimental autoimmune thyroiditis［J］.J Gene Med，2011，13（1）：3-16.

［5］ 李荣良，韩扣兰，戴小丽，等.人脐带间充质干细胞移植治疗Graves病小鼠的疗效［J］.山东医药，2013，53（36）：17-20.

［6］ Yanaba K，Bouaziz JD，Haas KM，et al.A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5＋phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses［J］.Immunity，2008，28（5）：639-650.

［7］ Matsushita T，Yanaba K，Bouaziz JD，et al.Regulatory B cells inhibit EAE initiation in mice while other B cells promote disease progression［J］.J Clin Invest，2008，118（10）：3420-3430.

［8］ Hussain S，Delovitch TL.Intravenous transfusion of BCRactivated B cells protects NOD mice from type 1diabetes in an IL-10-dependent manner［J］.Immunol，2007，179（11）：7225-7232.

［9］ Lenert P，Brummel R，Field EH，et al.TLR-9activation of marginal zone B cells in lupus mice regulates immunity through increased IL-10production［J］.J Clin Immunol，2005，25（1）：29-40.

［10］ Yanaba K，Hamaguchi Y，Venturi GM，et al.B cell depletion delays collagen-induced arthritis in mice：arthritis induction requires synergy between humoral and cell-mediated immunity［J］.J Immunol，2007，179（2）：1369-1380.

［11］ Mizoguchi A，Bhan AK.A case for regulatory B cells［J］.J Immunol，2006，176（2）：705-710.

［12］ Fujimoto M，Sato S.B lymphocytes and systemic sclerosis［J］.Curr Opin Rheumatol，2005，17（6）：746-751.

［13］ Zhang X，Ing S，Fraser A，et al.Follicular helper T cells：new insights into mechanisms of autoimmune diseases［J］.Ochsner J，2013，13（1）：131-139.

［14］ Matsushita T，Horikawa M，Iwata Y，et al.Regulatory B cells（B10cells）and regulatory T cells have independent roles in controlling experimental autoimmune encephalomyelitis initiation and late-phase immunopathogenesis［J］.J Immunol，2010，185（4）：2240-2252.

［15］ Mishima Y，Ishihara S，Aziz MM，et al.Decreased production of interleukin-10and transforming growth factor-βin Toll-like receptor-activated intestinal B cells in SAMP1／Yit mice［J］.Immunology，2010，131（4）：473-487.