非小细胞肺癌EGFR基因突变与ERCC1、TYMS mRNA表达相关性的研究＊

张 全，谭群友，王如文，陶绍霖，康珀铭，邓 波，周景海，李 坤，钱 凯，蒋 彬

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所胸外科，重庆400042）

肺癌是最常见的恶性肿瘤，肺癌病理类型中非小细胞肺癌（NSCLC）占75%～80%［1］。ⅠB～ⅢA 期的NSCLC 以手术治疗为主，并在术后根据肿瘤分期进行辅助化疗［2］。但部分NSCLC根治性切除后的辅助化疗效果欠佳。近年来，临床上开展的分子靶标检查能够判别患者个体差异，为NSCLC 的化疗和靶向治疗的药物选择提供科学指导，在NSCLC 治疗中的作用越来越受到重视。

IPASS研究发现表皮生长因子受体（EGFR）突变患者使用铂类化疗效果比野生型患者好［3］。台湾大学Wu等［4］发现EGFR 突变患者使用培美曲塞化疗相对于野生型患者有更高的有效率。目前认为，核苷酸切除修复交叉互补基因1（ERCC1）和胸苷酸合成酶（TYMS）分别是铂类和培美曲塞化疗的作用靶点，那么，EGFR 突变是否与ERCC1 和TYMS mRNA 具有相关性呢？本研究将对此进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年2～12月本科室收治的ⅠB～ⅢA 期的NSCLC患者97 例。其中，腺癌60例（61.8%），鳞癌29例（29.8%），其他8例，包括腺鳞癌6例、大细胞癌2例；男67例，女30例；年龄33～82岁；有吸烟史55例（56.7%），无吸烟史42例（43.3%）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 组织标本来自手术中切取或经皮肺穿刺获得的肿瘤组织，并经病理检查确诊。标本用10%甲醛固定后，由广州益善生物公司检测中心检测分析。

1.2.2 基因突变检测 使用SurPleRx-xTAG70plex液相芯片技术进行EGFR（E18、E19、E20、E21）基因突变检测。主要步骤：从固定样本中提取DNA；进行多重PCR 扩增；使用EXO-SAP对PCR 反应产物进行消化处理；进行等位基因特异引物延伸反应；将扩增产物与交联特异探针微球进行杂交反应；再将杂交后产物放入Luminex仪，读取数据［5］。

1.2.3 mRNA 表达水平检测 ERCC1、TYMS mRNA 表达使用分支DNA-液相芯片方法定量检测。分支DNA 液相芯片技术是省略RNA 抽取、逆转录和纯化等步骤，完成对mRNA表达水平的检测。在对样本裂解后，经过微球捕获，探针的多位点配对、级联增大的方法完成信号的放大，使用液相芯片对结果进行读数。

1.3 结果判定标准

1.3.1 EGFR 基因突变结果判定 首先，对液相芯片各突变型位点Cut-Off值进行确定，然后对样本检测每一突变型磁珠荧光值与Cut-Off值进行比较，进而判定检测样本的阴（阳）性。当检测样本的所有突变型磁珠荧光值均大于Cut-Off值，判断该样本为突变阳性；相反，则判断为阴性［6］。

1.3.2 ERCC1、TYMS mRNA 表达结果判定 检测结果以高、中、低表示，表达水平大于或等于75%为高表达，70%～＜75%为中偏高表达，40%～＜70%为中表达，25%～＜40%为中偏低表达，小于25%为低表达。各mRNA 基因表达水平的高低，反映化疗耐药的高低，表达水平越低，化疗的药物敏感性越高。因此，根据基因检测结果，把mRNA 表达水平的高表达、中偏高表达及中表达记为ERCC1（＋）、TYMS（＋），低或中偏低表达记为ERCC1（-）、TYMS（-）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行分析处理，EGFR 突变情况采用描述性统计分析方法，EGFR 突变与ERCC1、TYMS mRNA 表达相关性分析采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EGFR 基因突变情况 在97例检测样本中，发现EGFR基因突变29例，突变率为30%。其中，大部分集中在21号外显子 的 点突 变（48.3%，14／29）和19 号 外 显 子 的 缺 失 突 变（37.9%，11／29）；其余为18号外显子突变2例（6.8%，2／29），20号外显子突变2例（6.8%，2／29），18号外显子与20号外显子共同突变1例（3.4%，1／29）。EGFR 基因突变检出率方面，女性（70.0%，21／30）显著高于男性（11.9%，8／67），P＜0.05；腺癌（48.3%，29／60）显 著 高 于 非 腺 癌（0.0%，0／37），P＜0.05；无吸烟史患者（52.3%，22／42）突变率显著高于有吸烟史患者（12.7%，7／55），P＜0.05。在肿瘤分期和年龄方面比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 EGFR 基因突变与临床特征之间的关系

2.2 EGFR 突变与ERCC1mRNA 表达的关系 29例EGFR突变病例中，ERCC1阴性表达率62.1%（18／29），阳性表达率37.9%（11／29）；68例EGFR 野生型病例中，ERCC1阴性表达率39.7%（27／68），阳性表达率60.2%（41／68）。EGFR 突变与ERCC1表达有相关性（χ2＝4.088，P＜0.05），见表2。ERCC1基因表达与患者各临床特征间无显著相关性，见表3。

表2 EGFR 基因突变与ERCC1mRNA 表达 水平的关系（n）

表3 ERCC1mRNA 表达情况与临床特征间的关系（n）

表4 EGFR 基因突变与TYMS mRNA 表达 水平的关系（n）

表5 TYMS mRNA 表达情况与临床特征间的关系（n）

续表5 TYMS mRNA 表达情况与临床特征间的关系（n）

2.3 EGFR 突变与TYMS mRNA 表达的关系 29例EGFR突变病例中，TYMS阴性表达率58.6%（17／29），阳性表达率41.3%（12／29），68例EGFR 突变阴性病例中，TYMS阴性表达率52.9%（36／68），阳性表达率47.1%（32／68）。EGFR 突变与TYMS表达无明显相关性（χ2＝0.265，P＞0.05），见表4。TYMS mRNA 表达与患者各临床特征间无显著相关性（P＞0.05），见表5。

3 讨 论

近年来，随着肿瘤分子生物学和分子遗传学的不断发展，分子靶标基因检测在NSCLC 个体化治疗中的作用越来越受到重视。依托靶标检查进行的肺癌个体化治疗，是通过检查肺癌患者携带的药物疗效相关的靶标基因，按照患者个体的基因检测结果，为肺癌患者制订最佳的治疗方案，从而避免传统治疗的盲目性。本研究通过检查EGFR 突变与ERCC1 和TYMS在NSCLC 患者肿瘤组织中的mRNA 表达水平，并分析其间的相关性，为NSCLC的个体化治疗提供新的思路。

研究显示，靶向治疗只对EGFR 基因突变的患者有效，而对EGFR 基因野生型基本无效，因此，NSCLC 靶向治疗前检测EGFR 基因突变就显得尤为重要［7］。本研究结果显示，EGFR 基因突变率为30%，主要为21号外显子的点突变和19号外显子的缺失，在女性、无吸烟史、腺癌患者EGFR 突变检出率远高于男性、有吸烟史、鳞癌的患者，与IPASS研究报道相符［3］。

ERCC1与铂类化疗药物耐药的发生有关，ERCC1mRNA表达高低与铂类药物化疗效果呈负相关，在使用铂类药物化疗前检测ERCC1mRNA 表达可预测铂类药物化疗的耐药性或敏感 性［8-9］。Kalogeraki等［10］分析了45例NSCLC 的EGFR突变及ERCC1mRNA 表达情况，发现ERCC1低表达者具有更高的总生存率（OS），ERCC1 阳性表达中EGFR 突变率为14.8%，ERCC1阴性表达中EGFR 突变率为33.3%。研究发现，受损的核苷酸切除修复酶可引起细胞DNA 的损害，致使EGFR 突变率升高，ERCC1低表达肺肿瘤细胞DNA 受损修复能力较差，导致EGFR 基因更易出现突变，最终产生的结果是EGFR 基因突变对铂类为基础的化疗药物敏感性更高［11］。本研究显示，EGFR 基因突变与ERCC1mRNA 表达具有显著的相关性，与文献报道一致［10，12-13］。

研究显示，TYMS与培美曲塞的耐药发生相关，低表达的TYMS mRNA 患者使用培美曲塞化疗效果较好，而高表达患者疗效较差；对晚期肺腺癌患者采用培美曲塞单药治疗，EGFR 突 变 组RR 和 中 位PFS均优于野生组［4，14］。为什么EGFR突变组的生存率要优于野生组呢？Giovannetti等［15］研究发现，EGFR 突变的H1650细胞株表达低水平的TYMS酶可能是导致EGFR 突变组生存率较好的原因。但本研究显示，EGFR 基因突变与TYMS基因表达无明显相关性。分析其原因，可能是本研究样本量较小，尚有待今后大样本的研究进一步证实。

本研究发现了非小细胞肺癌EGFR 突变患者中ERCC1阴性表达率较高，由此推断EGFR 突变的NSCLC 使用铂类的化疗效果可能较好。但临床上是否能得出这一结论，还需要对这些患者进行长期随访。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］ Ettinger DS，Akerley W，Borghaei H，et al.Non-small cell lung cancer，version 2.2013［J］.J Nati Compr Canc Netw，2013，11（6）：645-653.

［3］ Fukuoka M，Wu YL，Thongprasert S，et al.Biomarker analyses and final overall survival results from a phase Ⅲ，randomized，open-label，first-line study of gefitinib versus carboplatin／paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer in Asia（IPASS）［J］.J Clin Oncol，2011，29（21）：2866-2874.

［4］ Wu SG，Yang CH，Yu CJ，et al.Good response to pemetrexed in patients of lung adenocarcinoma with epidermal growth factor receptor（EGFR）mutations［J］.Lung Cancer，2011，72（3）：333-339.

［5］ Xu J，He J，Yang H，et al.Somatic mutation analysis of EGFR，KRAS，BRAF and PIK3CA in 861patients with non-small cell lung cancer［J］.Cancer Biomark，2011，10（2）：63-69.

［6］ Schmitt M，Bravo IG，Snijders PJ，et al.Bead-based multiplex genotyping of human papillomaviruses［J］.J Clin Microbiol，2006，44（2）：504-512.

［7］ Mitsudomi T，Morita S，Yatabe Y，et al.Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor（WJTOG3405）：an open label，randomised phase 3trial［J］.Lancet Oncol，2010，11（2）：121-128.

［8］ Larminat F，Bohr VA.Role of the human ERCC-1gene in gene-specific repair of cisplatin-induced DNA damage［J］.Nucleic Acids Res，1994，22（15）：3005-3010.

［9］ 钟宏，冷雪峰，阳诺，等.非小细胞肺癌组织中ERCC1 mRNA 表达的及其与辅助化疗和预后的关系［J］.重庆医学，2014，43（9）：1058-1060.

［10］ Kalogeraki A，Karvela-Kalogeraki I，Tamiolakis D，et al.ERCC1expression correlated with EGFR and clinicopathological variables in patients with non-small cell lung cancer.An immunocytochemical study on fine-needle aspiration biopsies samples［J］.Rev Port Pneumol，2014，20（4）：200-207.

［11］ Olaussen KA，Fouret P，Kroemer G.ERCC1-specific immunostaining in non-small-cell lung cancer［J］.N Engl J Med，2007，357（15）：1559-1561.

［12］ 李梅芳，欧阳学农，余宗阳，等.非小细胞肺癌EGFR 突变与ERCC1和BRCA1表达相关性的研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2012，19（18）：1393-1396.

［13］ Gandara DR，Grimminger P，Mack PC，et al.Association of epidermal growth factor receptor activating mutations with low ERCC1gene expression in non-small cell lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2010，5（12）：1933-1938.

［14］ Kotoula V，Krikelis D，Karavasilis V，et al.Expression of DNA repair and replication genes in non-small cell lung cancer（NSCLC）：a role for thymidylate synthetase（TYMS）［J］.BMC Cancer，2012，12（1）：342.doi：10.1186／1471-2407-12-342.

［15］ Giovannetti E，Lemos C，Tekle C，et al.Molecular mechanisms underlying the synergistic interaction of erlotinib，an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，with the multitargeted antifolate pemetrexed in nonsmall-cell lung cancer cells［J］.Mol Pharmacol，2008，73（4）：1290-1300.