阿托伐他汀联合L-4F对apoE缺失小鼠HDL功能及水平的影响

李 鹏，程 诚，毕明辉，王月刚△，吴平生

（1.南方医科大学南方医院心内科，广州510515；2.中山大学附属第五医院内科，广东珠海519000）

冠心病严重危害人类健康，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是其主要病理基础。在AS 发生发展过程中氧化应激、炎性反应及血脂异常具有重要作用［1-2］，氧化应激可促进低密度脂蛋白（LDL）氧化修饰，导致血管内皮损伤，进而激活炎性因子，进一步增加炎性反应，促进斑块形成。所以，抗氧化、抗炎对于抗AS具有积极意义［3］。氧磷酸酶（PON1）是重要抗氧化酶，通过抑制低密度脂蛋白胆固醇（LDL-L）氧化修饰等途径达到抗AS作用；髓过氧化物酶（MPO）是强致氧化物酶，通过破坏高密度脂蛋白胆固醇（HDL-L）逆转运途径，导致炎性反应。本研究通过采用高脂饮食喂养appE缺失（apoE-／-）小鼠建立AS模型，比较阿托伐他汀联合载脂蛋白A-I（apoA-I）模拟肽（L-4F）对AS小鼠血清PON1、MPO活性及LDL-C、HDL-C水平的影响，探讨阿托伐他汀联合L-4F抗AS机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级8周龄apoE-／-小鼠，雄性，体质量18.5～21.5g，适龄、健康，共50只，SPF 级8 周龄C57BL／6J小鼠，体质量18.5～21.5g，适龄、健康，共20只，均购自北京大学医学部实验动物科学部。两种小鼠均饲养在南方医院实验动物中心，饲养温度控制在25 ℃，湿度7%，自动通风器保持室内通风。普通饲料及高脂饲料均购自广东省医学实验动物中心。

1.2 实验材料 阿托伐他汀购自辉瑞制药有限公司，L-4F购自深圳瀚宇药业有限公司，L-氨基酸序列如下：ACDWFKAKYDAKVAEKFKEAF-NH2由深圳翰宇药业股份有限公司提供。乙酸苯酯购自美国Sigma公司；血清MPO 活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。AU-5421型生化自动分析仪为日本Olympus公司生产；Universal 16R 型低温冷冻高速离心机为美国Thermo公司生产；ND-1000Spectrophotometer型分光光度仪为美国生产。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及给药 C57BL／6J小鼠20只给予常规饮食，作为正常对照组；apoE-／-小鼠给予高脂饮食［4］作为模型组（50只）。分别给予4周饮食后，选择两种小鼠各10只，检测相应的血清指标，作为基线值。其余apoE-／-小鼠分为4组，模型对照组、阿托伐他汀组、L-4F 组、阿托伐他汀联合L-4F组，每组10 只。正常对照组：普通饲料喂养，并给予灌服和（或）腹腔注射等体积生理盐水。模型对照组：高脂饲料喂养，同时给予灌服和（或）腹腔注射等体积生理盐水。阿托伐他汀组：在高脂饲料喂养基础上，经灌胃给药阿托伐他汀1.3mg·kg-1·d-1。L-4F组：在高脂饲料喂养基础上，腹腔注射给药L-4Fmg·kg-1·d-1。阿托伐他汀联合L-4F组：在高脂饲料喂养基础上，经灌胃给药阿托伐他汀1.3 mg／kg和腹腔注射L-4Fmg·kg-1·d-1。实验第4 周，取正常对照组及模型组小鼠各10只在空腹12h状态下采用乙醚吸入麻醉后死后，实验第8周同样方法处死剩余小鼠，心脏采血，3 000r／min离心15min，取上清，置于-80 ℃冰箱保存，统一检测血清各指标。

1.3.2 血清中PON1、MPO 活性及LDL-L、HDL-L水平的测定 血清PON1活性测定参考Tang等［5］的检测方法，以乙酸苯酯为底物，采用分光光度计法测定血清PON1 活性。血清MPO 活性根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行测定。血脂测定采用酶法用日本Au-5421型全自动生化仪上测定血清LDL-C、HDL-C水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析，所有计量资料以±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验分析，多组间总体均数比较，在方差齐时采用单向方差分析，方差不齐时采用Welch校正检验。多个样本均数间的多重比较方差齐时采用LSD 法检验，方差不齐时采用Dunnett′sT检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清PON1、MPO 活性的比较

2.1.1 不同时间点组内比较 正常对照组小鼠血清PON1、MPO 活性第8 周末与第4 周末相比差异无统计学意义（均P＞0.05）。模型对照组小鼠血清PON1活性第8周末较第4周末明显降低，而小鼠血清MPO 活性第8周末较第4周末明显升高（均P＜0.01）。见表1。

2.1.2 同时间点组间比较 模型对照组与正常对照组同期相比，小鼠血清PON1、MPO 活性在第4周末时差异无统计学意义（均P＞0.05），第8周末时模型对照组小鼠血清PON1活性明显低于正常对照组（P＜0.01），而小鼠血清MPO 活性则明显高于正常对照组（P＜0.01）。阿托伐他汀组、IL-4组小鼠第8周末血清PON1 活性显著高于同期模型对照组（均P＜0.01），MPO 活性显著低于模型对照组，但血清PON1活性显著低于同期正常对照组（P＜0.01），而血清MPO 活性显著高于同期对照组（P＜0.01）。而L-4F组与同期阿托伐他汀组比较二者差异无统计学意义（均P＞0.05）。阿托伐他汀联合L-4F组小鼠第8周末血清PON1活性较同期模型对照组、阿托伐他汀组及L-4F 组均显著增加（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05），而血清MPO 活性较同期模型对照组、阿托伐他汀组和L-4F组显著降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），与同期对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 各组小鼠血清LDL-C、HDL-C水平

2.2.1 不同时间点组内比较 正常对照组小鼠第8周末血清LDL-C、HDL-C水平与第4周末均无明显差异（均P＞0.05）。模型对照组小鼠血清LDL-C水平第8周末显著高于第4周末（P＜0.05）。而血清HDL-C 水平小鼠第8周末显著低于第4周末（P＜0.05）。见表2。

表1 对apoE-／-小鼠血清PON1、MPO 活性的影响（±s）

表1 对apoE-／-小鼠血清PON1、MPO 活性的影响（±s）

a：P＜0.01，与同组第4周末比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与同期正常对照组同期比较；d：P＜0.05，e：P＜0.01，与同期AS模型组比较；f：P＜0.05，g：P＜0.01，与同期阿托伐他汀比较；h：P＜0.05，i：P＜0.01，与L-4F组比较；-：此项无数据。

组别 n PON1活性第4周末（U／mL） 第8周末（U／mL）MPO 活性第4周末（U／L） 第8周末（U／L）正常对照组 10 120.51±7.46 117.34±8.32 26.54±2.46 29.34±2.32模型对照组 10 116.75±9.21 96.69±6.26ac 32.75±2.21 48.69±3.26ac阿托伐他汀组 10 - 107.12±7.53ce - 39.02±2.53ce L-4F组 10 - 104.75±6.14ab - 41.75±5.23ce阿托伐他汀联合L-4F组 10 - 115.68±8.48efh - 32.68±3.28eg i

表2 对apoE-／-小鼠血清LDL-C、HDL-C水平的影响（±s）

表2 对apoE-／-小鼠血清LDL-C、HDL-C水平的影响（±s）

a：P＜0.05，与同组第4周末比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与同期正常对照组同期比较；d：P＜0.05，e：P＜0.01，与同期模型对照组比较；f：P＜0.01，与同期L-4F组比较。-：此项无数据。

组别 n LDL-C第4周末（mmol／L） 第8周末（mmol／L）HDL-C第4周末（mmol／L） 第8周末（mmol／L）正常对照组10 0.47±0.11 0.54±0.12 2.44±0.46 2.54±0.21模型对照组 10 8.42±1.01 9.78±1.13a 2.85±1.21 2.48±0.32a阿托伐他汀组 10 - 8.21±1.08ce - 2.84±0.37d L-4F组 10 - 9.54±1.05c - 2.58±0.45阿托伐他汀联合L-4F组 10 - 7.76±1.02cef - 3.08±0.48 cef

2.2.2 同时间点组间比较 阿托伐他汀组第8周末小鼠血清LDL-C水平显著高于同期正常对照组（P＜0.01），较同期模型对照组显著降低（P＜0.05）。而小鼠血清HDL-C 水平较同期模型对照组显著升高（P＜0.05）。L-4F组第8周末小鼠血清LDL-C、HDL-C水平与同期模型对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。阿托伐他汀联合L-4F组小鼠第8周末血清LDL-C水平较模型对照组、L-4F组显著降低（均P＜0.01），而血清HDL-C水平显著升高（P＜0.01）。见表2。

3 讨 论

目前关于AS发病机制研究较多，但尚未有一致结论［6-7］。在AS发生发展过程中氧化应激、炎性反应及血脂异常具有重要作用，HDL的抗AS作用主要表现在其促进胆固醇逆转运，但其抗氧化抗炎功能也发挥重要作用［8-9］。阿托伐他汀为HMG-CoA 还原酶选择性抑制剂，通过抑制HMG-CoA 还原酶和胆固醇在肝脏的合成，降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，并能不同程度地提高血浆HDL-C和载脂蛋白A1的水平。L-4F具有促胆固醇逆转运作用以及改善血管舒张功能、减轻AS程度、抑制炎症因子分泌以及内皮保护等作用［10-11］。PON1活性及MPO 活性可反映HDL的抗氧化抗炎功能。

PON1是HDL重要的抗氧化酶之一，可抑制LDL 被氧化修饰及脂质过氧化物堆积，从而发挥抗AS 的作用。动物研究［12］发现，PON1 敲除鼠易发生AS，而且与正常鼠相比，其HDL和LDL 更容易被氧化。本研究也发现AS模型组血清PON1活性较正常对照组明显下降，与以上结论一致。MPO是一种强氧化酶，以H2O2作为底物，可产生硝基化等中间产物，中间产物以apoA-I为靶点，使得结构发生改变，促进氧化。与AS模型对照组比较，各药物组血清PON1活性显著升高，而MPO 活性显著降低，两药联用比单药应用有显著差异，提示阿托伐他汀和L-4F均有助于升高血清PON1活性、降低血清MPO 活性，从而改善HDL的抗氧化功能，两药联用可以更进一步改善HDL抗氧化功能，优于单药使用。这为临床应用提供了新的思路和方向。

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