人工重组促红细胞生成素对激素冲击大鼠股骨头坏死的预防作用

蒋鲁勇　颜勇卿　余　霄　庞清江(宁波大学医学院，浙江　宁波　352)

人工重组促红细胞生成素对激素冲击大鼠股骨头坏死的预防作用

蒋鲁勇颜勇卿1余霄1庞清江1
(宁波大学医学院，浙江宁波315211)

〔摘要〕目的探讨人工重组促红细胞生成素(rHuEPO)对激素冲击大鼠缺血性股骨头坏死的预防作用。方法健康成年Wistar大鼠24只，雌雄各半。随机分为三组。阳性对照组:大鼠后腿肌注地塞米松(Dex) 1 mg/kg体重(BW)，2次/w，连续5 w;阴性对照组:同样方法注射生理盐水;实验组:大鼠后腿肌注Dex 1 mg/kg BW，2次/w，连续5 w，并且每日腹腔内注射500 U/kg体重rHuEPO至5 w。制模后全部处死取材，取双侧股骨头标本，一侧切片后HE染色，并用光学显微镜观察骨组织、骨髓组织、骨小梁结构变化。另一侧切片后免疫组化法CD31染色观察微血管变化。结果阳性对照组HE染色发现骨小梁明显稀疏、变窄，形态不规则，骨小梁分割程度下降并伴有较多破骨细胞出现，部分可见骨细胞胞核皱缩、溶解、消失。而实验组较阳性对照组，病变明显减轻，骨小梁形态较为规则，小梁连接程度明显优于阳性对照组，部分骨小梁较粗，断裂明显减少，骨小梁分割程度较高且可见较多成骨细胞。免疫组化测CD31显示阳性对照组CD31表达要明显低于阴性对照组与实验组(P＜0.05)。结论rHuEPO可以有效地预防骨细胞凋亡，延缓或降低股骨头坏死的发生。

〔关键词〕人工重组促红细胞生成素;激素;股骨头坏死

1宁波第二医院骨科中心

第一作者:蒋鲁勇(1988-)，男，硕士，住院医师，主要从事骨关节疾病研究。

激素性股骨头坏死(SANFH)不仅起病快，进程快，预后差，而且还具有易致股骨头塌陷及致残率高等临床特点。SANFH发病的最终因素是其股骨头内部出现供血不足的现象，并且血运重建受到障碍，最终造成骨细胞坏死〔1～4〕。因此，治疗股骨头缺血性坏死的关键就是促进坏死区血管再生和新骨形成。促红细胞生成素(EPO)是一种分子量约30 kD、热稳定(80℃)的单链酸性糖蛋白。研究证实，EPO不但能够有效促进红细胞生成，同时还有保护细胞的作用，特别是能够阻止内皮细胞、神经细胞和心肌细胞凋亡，促进新生血管的生成〔5〕。本研究旨在探讨人工重组(rHu) EPO对激素冲击大鼠缺血性股骨头坏死的预防作用。

1　材料与方法

1.1大鼠激素性股骨头缺血性坏死模型的建立健康成年Wistar大鼠24只，雌雄各半，体重约为300 g。均在同一条件下饲养，均采用普通颗粒饲料，采取自然光照，温度(20±2)℃，湿度50％左右。1 w后称重，随机分为阳性对照组、阴性对照组、实验组，每组8只，雌雄各半。3组体重无统计学差异(P＞0.05)。均符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。阳性对照组:后腿肌注地塞米松(Dex) 1 mg/kg体重，2次/w，连续用药5 w;阴性对照组同样方法注射等量生理盐水;实验组后腿肌注Dex 1 mg/kg体重，2次/w，连续5 w，并且每日腹腔内注射500 U/kg体重rHuEPO至5 w。

1.2大体观察每天注意观察生命状态、进食情况、体重、精神状态、排泄情况及有无体表感染等，准确称重。为了增加动物的活动量，实行每天定时活动2 h，尽可能使模型的建立更加合理。

1.3HE染色5 w后各组麻醉后放血处死，切取双侧股骨头标本用于HE染色及免疫组化检测CD31。进行取材标本时小心剔除周围软组织，仔细注意股骨头是否光滑完整，形态是否正常及冠状面的色泽、切开时阻力大小等等。将所取标本用10％中性甲醛溶液(0.1 mol/L，pH7.4) 4℃固定4 d，然后PBS溶液冲洗，放在缓冲液大约10％乙二胺四乙酸(EDTA-Tris)溶液里，37.4℃脱钙，该方法实行每周1次，仔细注意骨表面的颜色，并且采用物理法准确测量脱钙程度。如果完全脱钙后进行取材，乙醇对梯度逐级脱水，二甲苯透明处理2 h，用石蜡包埋，切开片面后行HE染色。利用在光学显微镜下观察骨组织、骨髓组织、骨小梁结构变化。

1.4免疫组化测定CD31取相应的股骨头标本，沿冠状面纵行剖开，给予多聚甲醛固定液大约40 g/L中，放在4℃冰箱内，放置48 h，石蜡切片SP免疫组化。CD31阳性信号定位于血管内皮细胞质，呈棕黄色颗粒。在显微镜下观察，随机抽取3个每张免疫组化切片不同视野(×400)计数呈棕黄色的阳性表达血管。

1.5统计学方法采用SPSS18.0统计学分析软件对数据的组间比较进行t检验。

2　结果

2.1一般情况各组大鼠状态良好。5 w后阳性对照组和实验组大部分后肢和背部毛发脱落、稀疏;而阴性对照组毛发无明显改变。整个实验期间，无动物死亡，阳性对照组有部分动物活动减少，食欲可;其余两组未见明显异常。

2.2HE染色结果①阴性对照组:雄性和雌性大鼠骨小梁结构完整，呈圆形或椭圆形拱形结构，骨小梁连接性高，骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞相对少，无破骨细胞和骨小梁变窄、断裂出现。②阳性对照组:雄性中3只大鼠可见骨小梁明显稀疏、变窄、断裂、连接率降低，部分拱形结构消失，形态不规则，骨小梁分割程度下降并伴有较多破骨细胞出现，部分可见骨细胞核皱缩、溶解、消失;雌性中有3只可见上述病变。其他2只均有不同程度的骨小梁变窄、连接率降低等病变产生。③实验组:较阳性对照组，雄性和雌性病变明显减轻，骨小梁形态较为规则，小梁连接程度明显优于阳性对照组，部分骨小梁变粗，断裂明显减少，缺损处出现连接和修复，部分结构接近正常组，骨小梁分割程度较高且可见较多成骨细胞。见图1。

图1　各组股骨头的组织病理学变化

2.3免疫组化检测CD31的表达CD31抗体免疫组化染色能清晰地选择性地显示血管内皮细胞，呈棕黄色颗粒，而其他组织不着色。显微镜下随机视野计数血管染色后。与阴性对照组和实验组比较，阳性对照组CD31低表达，见表1。①阴性对照组: CD31表达丰富，股骨头血供充足，微循环正常;②阳性对照组: CD31染色计数明显减少，棕黄色较淡，提示微循环不足，股骨头血供下降明显(P＜0.001) ;③实验组:相比阳性对照组CD31染色计数增多，血供相对增加(P＜0.05)。见图2。

表1　各组股骨CD31的表达染色计数(±s，n=4)

表1　各组股骨CD31的表达染色计数(±s，n=4)

与阴性对照组比较: 1) P＜0.001;与阳性对照组比较: 2) P＜0.05，3) P＜0.01

组别　　雄　　雌阴性对照组　26.00±6.02　27.67±7.99阳性对照组　12.72±3.391)　14.11±5.021)实验组　15.61±3.132)　18.94±4.223)

图2　各组免疫组化检测CD31结果(×400)

3　讨论

胡长根等〔6〕发现激素可诱导微血管内皮细胞的凋亡引起毛细血管数量减少，可能诱导微循环障碍。当长期大剂量使用糖皮质激素时，随着股骨头微血管密度(MVD)的下降，血流灌注量逐渐减少，股骨头血流量逐渐下降，随着血流量用药时间的延长而进一步降低。导致骨组织细胞缺血，发生缺氧及各系细胞发生脂肪变性。当缺血和缺氧到达某一阈值时即发生骨坏死。目前有多种保头的治疗方法，其中髓芯减压是目前比较常用的方法。该方法的主要机制在于能够逐渐恢复股骨头的血液循环，减少股骨头内的压力，采用髓芯钻孔减压，能够减轻骨髓水肿同时还能有效改善股骨头血液循环、最终达到治愈疾病的目的。

EPO能够促进网织红细胞和内皮细胞的增殖分化，刺激形成血管及再生细胞，具有抗细胞凋亡、抗炎、抗氧化、血管生成及促进细胞增殖和保护作用。一方面EPO能够抗氧化、抗细胞凋亡、调节炎症反应、减轻心肾组织损伤和促血管新生等多方面的骨髓造血以外的功能，另一方面，增加红细胞生成来提高组织氧灌注，因此影响慢性心力衰竭和肾功能不全的组织重塑和纤维化进程〔5，7〕。研究表明，心力衰竭伴贫血的患者，使用EPO治疗贫血可能改善心功能，降低其住院率〔8〕。张嘉熙等〔9〕通过体外培养小鼠骨髓基质细胞系(ST2)，加入EPO后，采用实时PCR方法检测成骨细胞相关基因的表达，结果显示EPO组与对照组相比，钙沉积明显增多，成骨相关基因的表达也增高，得出EPO对成骨细胞的分化和功能有明显的促进作用。Hu等〔10〕发现EPO可通过抑制p38MAPK活化、降低肿瘤坏死因子(TNF) -α水平、减轻炎性损伤等显著改善大鼠肾脏缺血再灌注损伤后的肾功能异常，对肾移植后早期肾功能恢复提供了帮助。Ishii等〔11〕发现EPO预处理可减少脑梗死面积和神经细胞凋亡的数量，从而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。Ahn等〔12〕研究表明EPO能促进血管生成、改善血液流动，能有效改善小鼠下肢循环，为临床恢复急性动脉栓塞后的血液灌注提供新的思路和实验依据。本实验说明rHuEPO可以减少骨细胞凋亡，进而阻止股骨头坏死的发生。由此推测rHuEPO可能通过微循环的改善，实现预防股骨头坏死。采用rHuEPO进行治疗，短期效果明显，但是长期疗效和预防作用的机制还需深入探讨。

4　参考文献

1焦庆丰.激素性股骨头坏死发病机制的研究进展〔J〕．临床骨科杂志，2010; 13(3) : 329-31.

2薛元锁，时述山，李亚非，等．激素性股骨头坏死病程中骨形态发生蛋白－2的改变及其意义〔J〕．中华实验外科杂志，2000; 17(5) : 455-6．

3吴星火，杨述华.脂肪组织巨噬细胞在激素性股骨头坏死发病机制及治疗中的作用〔J〕．中华骨科杂志，2013; 33(7) : 776-8.

4王玉辉，刘又文.激素性股骨头坏死发病机制的研究进展〔J〕．中医临床研究，2012; 21(1) : 121-2.

5 Holstein JH，Orth M，Scheuer C，et al.Erythropoietin stimulates bone formation，cell proliferation and angiogenesis in a femoral segmental defect model in mice〔J〕．Bone，2011; 49(5) : 1037-45.

6胡长根，陈君长.激素对股骨头微血管及组织细胞的影响〔J〕．中华骨科杂志，2004; 24(6) : 359-63.

7杨元生，陈垦，石星亮，等.促红细胞生成素的临床应用进展〔J〕．中华全科医学，2009; 7(9) : 992-4.

8 Ngo K，Kotecha D，Walters JA，et al.Erythropoiesis-stimulating agents for anaemia in chronic heart failure patients〔J〕．Cochrane Database Syst Rev，2010; 12(2) : 123-6.

9张嘉熙，史册，刘姗姗，等.促红细胞生成素促进骨髓基质细胞成骨分化的实验研究〔J〕．口腔颌面外科杂志，2014; 24(1) : 21-6.

10 Hu L，Yang C，Zhao T，et al.Erythropoietin ameliorates renal ischemia and reperfusion injury via inhibiting tubulointerstitial inflammation〔J〕．J Surg Res，2012; 176(1) : 260-6.

11 Ishii T，Asai T，Fukuta T，et al.A single injection of liposomal asialoerythropoietin improves motor function deficit caused by cerebral ischemia/reperfusion〔J〕．Int J Pharm，2012; 439(1-2) : 269-74.

12 Ahn S，Min SK，Min SI，et al.Early sustained injections of erythropoietin improve angiogenesis and restoration of perfusion in the ischemic mouse hindlimb〔J〕．J Korean Med Sci，2012; 27(9) : 1073-8.

〔2014-06-19修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者:庞清江(1963-)，男，博士，硕士生导师，主任医师，主要从事人工关节、骨质疏松研究。

基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(No．LY12H06002)

〔中图分类号〕R68

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4471-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.022