益气养阴化浊通络方对糖尿病肾病大鼠转化生长因子-β1/Smads信号通路的影响

卞　华　吕　芹胡久略　毛秉豫　叶松山(南阳理工学院医学实验中心，河南　南阳　473004)

益气养阴化浊通络方对糖尿病肾病大鼠转化生长因子-β1/Smads信号通路的影响

卞华吕芹1胡久略毛秉豫叶松山
(南阳理工学院医学实验中心，河南南阳473004)

〔摘要〕目的观察益气养阴化浊通络方对糖尿病肾病(DN)大鼠转化生长因子(TGF) -β1/Smads信号通路的影响，探讨其对DN的作用机制及治疗效果。方法选择50只健康雄性SD大鼠，随机分为正常组10只，造模组40只。造模组大鼠接受单侧肾切除手术2 w后，给予高糖高脂饮食4 w，再加用小剂量链脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射，造模组在DN模型成模后，随机分为模型组、中药组、西药组。中药组给予益气养阴化浊通络方煎剂，西药组给予贝那普利，治疗8 w后处死大鼠。测定血糖、24 h尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐的变化，同时检测肾组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白的表达。结果与模型组相比，中药组血糖、24 h尿蛋白量、血尿素氮及肌酐均显著降低(P＜0.01)，TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表达下调，Smad7蛋白表达增强(P＜0.05，P＜0.01)。结论在DN大鼠模型中，益气养阴化浊通络方能够改善肾功能，保护肾组织，调节TGF-β1/Smad信号通路是其作用机制之一。

〔关键词〕糖尿病肾病;益气养阴化浊通络方;转化生长因子(TGF) -β1; Smad蛋白

1南阳医学高等专科学校中医系

第一作者:卞华(1973-)，男，副教授，博士，主要从事中医药治疗内分泌疾病的研究。

糖尿病肾病(DN)的主要病理表现为肾小球肥大，细胞外基质(ECM)增生，肾小球系膜区增宽及毛细血管基底膜增厚，最后进展至肾小球硬化和肾间质纤维化。研究表明转化生长因子(TGF) -β1/Smads信号转导通路在DN的发生发展中起着重要作用〔1，2〕。本文前期临床研究显示，益气养阴化浊通络方能改善DN患者血清TGF-β1、基质金属蛋白酶(MMP) -9及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP) -1水平，降低结缔组织生长因子(CTGF)、Ⅳ型胶原水平而延缓DN的发展〔3，4〕。本研究旨在观察益气养阴化浊通络方对DN大鼠TGF-β1/Smads信号通路的干预作用，以进一步探讨其对DN的治疗作用及抗肾脏纤维化的机制。

1　材料与方法

1.1药物与试剂益气养阴化浊通络方煎剂，由黄芪、太子参、葛根、薏苡仁各30 g，生地黄、丹参各20 g，鬼箭羽15 g，丝瓜络、白芥子、穿山甲各10 g等药物组成，该方一剂共含生药220 g，水煎浓缩后使药液浓度相当于生药2.5 g/ml，2 000 r/min离心5 min，取上清液，置－20℃冰箱保存备用。贝那普利片: 10 mg，北京诺华制药有限公司，批号x1377。链脲佐菌素(STZ) (美国Sigma公司) ;血肌酐(Scr)试剂盒、血尿素氮(BUN)试剂盒(南京建成生物工程有限公司) ;兔抗大鼠TGF-β1抗体、山羊抗鼠磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)多克隆抗体、兔抗鼠Smad7单抗(美国Santa Cruz公司) ;辣根过氧化物酶标记IgG二抗(美国KPL公司) ; BCA蛋白检测试剂盒(美国Pierce公司)。

1.2DN模型制备及分组〔5，6〕雄性SD健康成年大鼠，体重(220±10) g，由郑州大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(豫) 2010-0002。选用清洁级健康雄性SD大鼠50只，普通饲料适应性喂养1 w，分别检测血糖、尿糖和尿蛋白均为阴性者用于实验。随机选取10只大鼠行左肾摘除假手术操作，作为正常组，其余40只大鼠行左肾摘除术，5万U青霉素腹腔冲洗并注射后缝合。手术后肌注2万U青霉素，共1 w。手术后2 w，正常组普通饲料喂养，其他各组给予高脂高糖饲料(60％普通饲料、10％的猪油、5％胆固醇、5％蛋黄粉和20％蔗糖)，随日龄增加，投料相应增多。4 w后，造模组大鼠一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(用0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，pH值4.2～4.5，配制成2％STZ溶液)，正常组大鼠一次性腹腔内注射等体积不含STZ的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，以3次连续随机尾静脉血糖≥16.7 mmol/L，尿糖强阳性()～()、尿量大于正常组的50％，24 h尿蛋白定量在30 mg以上者为DN造模成功。其中手术过程中意外死亡4只，2只大鼠血糖未达标准，剔除。造模组在DN模型成模后1 w，随机分为模型组(11只)、西药组(11只)、中药组(12只)。DN模型成模1 w后开始给药，正常组、模型组每天生理盐水灌胃，西药组予贝那普利1.0 mg·kg-1·d-1灌胃，中药组予中药煎剂22.9 g·kg-1·d-1灌胃，每日上午10∶00左右给药1次，连续给药8 w。实验期间，不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.3生化指标的检测给药结束后，取大鼠股动脉血，分离血清，BECKMAN CX7全自动生化分析仪检测血糖、Scr、BUN。24 h尿蛋白定量用双缩脲法测定。

1.4TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白检测Western印迹法检测。收集的肾组织加入蛋白裂解液裂解，冰浴30 min。4℃10 000 r/min离心10 min，收集上清，用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白定量，－70℃保存。取60 μg蛋白按常规方法进行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜。按0.1 ml/cm2加入封闭液，室温封闭2 h后，依次加入一抗(1∶1 000稀释)，室温下轻摇2 h，4℃孵育过夜。弃去反应液，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min;加入二抗(1∶2 000稀释)，37℃孵育1 h，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min。ECL发光试剂对硝酸纤维素膜进行显色反应，用Bio Rad-Image Lab全自动电泳凝胶成像系统分析仪成像并对免疫印迹条带进行半定量分析，用β-actin作內参照，以与β-actin的比值表示各组蛋白表达水平。

2　结果

2.1各组大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN变化情况的比较与正常组相比，模型组及两治疗组血糖、24 h尿蛋白定量、Scr、BUN均明显增高(P＜0.01) ;与模型组相比，两治疗组24 h尿蛋白定量、Scr、BUN及中药组血糖均明显降低(P＜0.05，P＜0.01) ;与西药组相比，中药组血糖、24 h尿蛋白定量、Scr显著降低(P＜0.01)。见表1。

2.2益气养阴化浊通络方对DN大鼠TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响Western印迹检测显示，与正常组相比，模型组、西药组、中药组TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7表达水平均异常(P＜0.05，P＜0.01) ;与模型组相比，西药组、中药组TGF-β1、p-Smad2/3表达降低，Smad7表达升高(P＜0.01) ;与西药组相比，中药组TGF-β1、p-Smad2/3表达改善更明显(P＜0.05)。见表2，图1。

表1　各组大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN比较(±s)

表1　各组大鼠血糖、尿蛋白、Scr、BUN比较(±s)

与正常组比较: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;与模型组比较: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;与西药组比较: 5) P＜0.05，6) P＜0.01，下表同

组别　n　　血糖(mmol/L)　　尿蛋白(mg/24 h)　Scr(μmol/L)　BUN(mmol/L)正常组模型组西药组中药组10 11 11 12 5.05±0.39 26.43±0.692)26.16±0.932)18.42±1.022) 4) 6)7.04±0.39 61.11±4.192)38.95±3.302) 4)34.75±3.362) 4) 5)45.44±5.46 137.56±5.682)89.43±6.672) 4)72.66±7.052) 4) 6)5.13±0.21 9.77±1.162)8.48±0.662) 3)8.22±0.562) 4)

表2　各组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达的变化(±s)

表2　各组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表达的变化(±s)

组別　n　 TGF-β1　p-Smad2/3　Smad7正常组模型组西药组中药组10 11 11 12 0.212±0.035 0.804±0.0712)0.451±0.0622) 4)0.367±0.0421) 4) 5)0.189±0.014 0.795±0.0522)0.516±0.0372) 4)0.328±0.0251) 4) 5)0.511±0.042 0.176±0.0132)0.268±0.0322) 3)0.305±0.0262) 4)

图1　Western印迹分析TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7在各组大鼠肾组织中的表达

3　讨论

TGF-β1是导致DN的关键性因子，高血糖、血管紧张素Ⅱ、糖基化终末产物等是激活TGF-β1/Smads信号通路的重要因素〔7〕。TGF-β1活化后与其受体结合，通过Smads蛋白将细胞外信号转导入细胞内，诱导肾小球及肾小管细胞肥大，促进ECM积聚，抑制ECM的降解，导致肾间质纤维化〔8〕。

Smads作为TGF-β1细胞内信号传递分子，调控细胞膜信号转导，活化型和辅助型Smad蛋白是正调控分子，而抑制型Smad蛋白是负调控分子。Smad2、Samd3是活化型Smad蛋白，为TGF-β1下游调节因子，在DN动物模型中均高表达，提示Smad2/Smad3在DN纤维化过程中起了重要作用〔9〕。Smad7为抑制型Smad蛋白，可与Smad2或Smad3竞争结合TGF-β受体Ⅰ，抑制Smad2 /Smad3磷酸化及向细胞核转移，增加泛素介导的TGF-β受体Ⅰ自身的降解，从而负性调节TGF-β1/Smad通路。Smad7作为内源性TGF-β1拮抗剂，抑制TGF-β1/Smads信号通路已得到公认〔10〕。因此，抑制TGF-β1的产生和(或)活性，拮抗或阻断TGF-β1/Smads信号途径可以减轻实验性肾纤维化的进展〔11〕。

本研究结果显示，经益气养阴化浊通络方治疗后，DN大鼠尿蛋白排泄减少，肾功能得到恢复，提示益气养阴化浊通络方具有抗纤维化作用，模型组TGF-β1、p-Smad2/3表达升高，表明存在TGF-β1/Smads信号转导通路的活化。与模型组比较，中药组TGF-β1、p-Smad2/3的表达有所下降，Smad7蛋白表达有所增强，说明益气养阴化浊通络方能上调肾脏组织中Smad7蛋白的表达，抑制TGF-β1、p-Smad2/3的表达，从而抑制TGF-β1/ Smads信号转导通路，发挥抗DN肾脏纤维化的作用。

4　参考文献

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〔2014-08-12修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目:河南省中医内科学重点学科支撑课题(2012) ;河南省中医学实验教学示范中心建设项目(2010)

〔中图分类号〕R259

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4432-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.006