毫针针刺对腧穴筋膜结缔组织细胞整合素β1、β3亚基和PCNA表达的影响

2015-03-05胡铁汉贵阳中医学院针灸推拿学院贵州贵阳550025

中国老年学杂志 2015年16期

李　程　陈　波　胡铁汉　陈　磊(贵阳中医学院针灸推拿学院，贵州　贵阳　550025)

李程1陈波胡铁汉陈磊
(贵阳中医学院针灸推拿学院，贵州贵阳550025)

〔摘要〕目的探讨毫针针刺对SD大鼠腧穴穴区筋膜结缔组织细胞2种整合素β亚基和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法将32只SD大鼠随机分为空白对照组、细针刺激组、中针刺激组(中等粗细毫针刺激组)和粗针刺激组，每组8只，除空白组外，针刺各组在大鼠中脘穴沿任脉循行方向平刺施以捻转平补平泻刺激，治疗1次/d，治疗3 d后，切取穴区筋膜结缔组织，采用免疫组化染色法，镜下观察腧穴穴区筋膜结缔组织整合素β1亚基(integrinβ1)、integrinβ3及PCNA蛋白表达。结果毫针针刺作用后，腧穴筋膜结缔组织integrinβ亚基的表达变化情况不同:细针刺激组和中针刺激组筋膜结缔组织中integrinβ1的表达比空白对照组均有增强，其中细针刺激组integrinβ1的表达统计无显著差异(P=0.314)，中针刺激组integrinβ1的表达有极显著差异(P = 0.000)，然而，粗针刺激组integrinβ1的表达较空白组明显下降，呈翻转趋势，差异显著(P = 0.001) ; integrinβ3除部分大小血管可见少量表达外，在腧穴筋膜结缔组织中始终为阴性表达;筋膜结缔组织中PCNA蛋白的表达均明显增强(P = 0.002，0.005，0.039)，其中细针刺激组最强。结论毫针针刺能够激发受治腧穴穴区细胞活性变化，其中β1类integrin是腧穴筋膜结缔组织中主要的力学信号蛋白，β3类integrin不是腧穴筋膜结缔组织中主要的力学信号蛋白，这可能进一步揭示了腧穴感受针刺治疗信号的非神经生物学细胞力学基本原理之一。

〔关键词〕毫针针刺;筋膜结缔组织;力感受分子;整合素β亚基;增殖细胞核抗原

1贵州省第二人民医院康复科

第一作者:李程(1988-)，女，住院医师，主要从事针灸推拿的基础与康复运用研究。

现代研究认为，毫针针刺实质上是一种复合机械刺激〔1〕，机械力刺激贯穿毫针针刺的整个过程。课题组前期引入离体细胞学实验初步验证了腧穴或经络区域筋膜结缔组织中未分化的潜能细胞——成纤维细胞〔2〕，能将力学刺激进行生物转换，合成和释放多种生化活性物质。本课题继续以腧穴筋膜结缔组织为研究对象，以免疫组化技术探讨针刺基本力学作用于腧穴力学信号传导通路中力感受器分子整合素(integrin)β1亚基和integrinβ3亚基的表达变化，以及受力穴区细胞增殖细胞核抗原(PCNA)情况的影响，为毫针针刺治疗作用的现代生物学原理提供进一步的实验证据。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组体重为180～220 g的雄性SD大鼠(SPF清洁级) 32只，购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号: SCXK(湘) 2009-0012。随机分为空白对照组、细针刺激组(36号毫针)、中针刺激组(30号毫针)、粗针刺激组(26号毫针)，每组8只。

1.2主要实验器材与试剂1寸毫针(苏州针灸用品有限公司)、半自动脱水机(Leica，德国)、全自动石蜡包埋机(Leica，德国)、全自动石蜡切片机(Leica，德国)、显微镜(Nikon，日本)、数码相机(Nikon，日本)、IGTB1(瑞博奥，中国北京，批号: 130705w)、IGTB3(Epitomics，美国，YI121306DS)、PCNA一抗(Abcam，英国，批号: YJ020304cs)、EnVision抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(Dako，丹麦)。

1.3方法

1.3.1动物实验的方法(1)刺激方法:针刺组大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉固定后，在大鼠腹部中脘穴处(参考《实验针灸学》〔3〕附录四，大鼠中脘穴定位脐上约20 mm)备皮，消毒沿任脉循行方向平刺刺入0.5 cm，按照平补平泻手法捻转5 min，捻转针体频率60 r/min(误差控制±2 r/min)，捻转幅度180°～360°，留针10 min，再捻转5 min，捻转完毕后以针尾为参照物顺时针捻转针体5圈，滞针10 min，10 min后逆时针回转针体5圈，出针，以消毒干棉球按压5～10 s。治疗1次/d，共治疗3 d。相同刺激参数下，各刺激组用相应型号的毫针，空白组做相同的麻醉、抓取、固定。(2)动物手术和取材方法:末次刺激后，将大鼠仰卧位固定，腹部中脘穴区进一步备皮、消毒，连皮取以大鼠的穴点为中心，边长约为2 cm正方形的皮下筋膜组织块，用生理盐水冲洗并立即放入10％中性缓冲甲醛溶液中固定，组织和固定液的比例为1∶10～1∶20。

1.3.2组织石蜡块制作组织块固定2～3 h，取出修剪组织成厚度在2 mm左右，边长＜7 mm的小块后，进一步经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后制成组织石蜡块，并作后期实验备用。

1.3.3指标检测腧穴筋膜结缔组织细胞integrinβ1、integrinβ3、PCNA表达测定，均采用免疫组化法，均按试剂盒要求操作。

1.3.4结果观察及处理免疫组化实验图片应用软件Image pro plus6.0进行分析，在同等参数设置下测定integrinβ1、integrinβ3、PCNA的积分光密度值(IOD)和阳性区域面积(area)，通过计算平均光密度(MD)反映目标物质的单位面积含量。

1.4统计学方法应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2　结果

2.1腧穴筋膜结缔组织细胞integrinβ1表达检测细针刺激组和中针刺激组筋膜结缔组织中integrinβ1表达(0.010 288±0.004 779 8，0.016 088±0.003 415 3)较空白对照组(0.008 550±0.003 228 0)均有增强，其中细针刺激组integrinβ1的表达与空白对照组无显著差异(P = 0.314)，中针刺激组integrinβ1的表达与空白对照组有极显著差异(P= 0.000)。相反，粗针刺激组integrinβ1的表达(0.002 000±0.001 043 3)明显下降，呈翻转趋势，与空白对照组有极显著性差异(P = 0.001)。见图1。

图1　各组“中脘”穴区筋膜组织细胞integrinβ1免疫组化的表达(×400)

2.2腧穴筋膜结缔组织细胞integrinβ3表达检测腧穴筋膜结缔组织中integrinβ3的表达呈阴性结果，部分大小血管有少量表达。见图2。

图2　各组“中脘”穴区筋膜结缔组织integrinβ3免疫组化的表达(×200)

2.3腧穴筋膜结缔组织细胞PCNA表达检测针刺治疗组腧穴筋膜组织中PCNA的释放均比较空白对照组(0.001 525± 0.000 399 1)明显增强，其中细针刺激组(0.006 800± 0.004 639 6)和中针刺激组(0.006 288±0.002 610 1) PCNA的表达有极显著差异(P= 0.002，0.005)，粗针刺激组PCNA的表达(0.004 950±0.003 385 3)与空白对照组有显著差异(P = 0.039)。其中，针刺刺激组PCNA释放增加的强度呈略微下降趋势:细针刺激组＞中针刺激组＞粗针刺激组。见图3。

图3　各组“中脘”穴区筋膜结缔组织PCNA免疫组化的表达(×400)

3　讨论

现代实验针灸学研究认为〔3〕，针刺腧穴后，其作用机制的始动环节在穴位感受器(游离神经末梢、肌梭、环层小体、克氏终球及关节囊感觉器)，穴位感受器将针刺机械刺激转化为神经冲动(生物电信号)，并通过神经调节和神经-体液调节发挥防治疾病作用。但陈波等〔4〕对现代细胞生物力学的广泛研究发现除了以往认知的神经组织神经元以外，机体其他组织(上皮组织、结缔组织、肌组织的血管内皮细胞、成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞等)都是力学敏感细胞，力学刺激均可诱使这些细胞将机械信号转化为生物化学信号，因此曾提出了广义穴位感受器的学术观点，并立足于此研究针刺治疗的作用机制，逐步从生物物理学的角度建立起针刺效应的非神经组织细胞生物学启动机制构想。众多的研究者发现穴位并不能由一种组织学说来阐述说明时，转向综合性、整体性的研究，赞同穴位的立体构筑学说〔5〕，即由多种组织构成，共同参与穴位的传导作用，但不同的穴位由某一种或几种组织起着主要作用。同时有学者认为腧穴位于“筋膜支架”〔6〕较粗的珠样部位，其存在以纤维(胶原纤维、弹性纤维和网状纤维)为框架，以成纤维细胞为主要细胞主体和以细胞分泌的胞外基质(ECM)为主要成分建构遍布全身的空间网络中，不仅作为发挥力学功能的载体，并且参与物质、信息和能量的传输和调节，构成一个能够对生物机体内外环境发生反应的动态平衡体系。因此，研究毫针针刺对穴区筋膜组织细胞力感受始动机制和效应反应，可能是进一步认识针刺治疗作用基本和必然途径之一。

生物细胞力学的研究表明: ECM-整合素-细胞骨架是细胞力学信号传导的经典途径和重要通路〔7〕。integrin作为跨膜细胞黏附分子家族的重要成员之一，目前被认为是大多数细胞共有的力的感受器〔8〕。1987年，Hynes等首次提出integrin的概念，因其使细胞得以附着而形成一个整体故名。integrin家族是一类由α亚单位(120～185 kD)和β亚单位(90～110 kD)以1∶1比例通过非共价键连接而构成的异二聚体跨膜黏蛋白，目前已经确认的有18种α亚单位和8种β亚单位，按照不同的组合共构成至少24种integrin〔9〕。integrinβ按亚单位可分类为β1、β2、β3三个亚家族:其中β1亚家族称为VLA家族，主要存在于各种体细胞表面，主要介导细胞与ECM成分之间的黏附;含β2亚家族称为白细胞整合素，主要存在于各种白细胞表面，介导多种细胞间的相互作用;β3亚家族称为细胞黏附素，主要存在于血小板表面，含人玻璃黏蛋白受体(VNR)和血小板的gp Ⅱb/Ⅲa，介导血小板的聚集，并参与血栓形成。integrin作为跨膜蛋白在ECM→整合素→细胞膜→细胞骨架这一信号传导通路中起到关键的“信号中转站”作用，主要介导细胞与细胞、细胞与ECM之间的相互黏附，并介导力学信号在细胞内外之间的双向传导〔10〕。integrin对于介导针刺生物力学信号传导作用的研究基本还是一个空白，课题组前期通过体外实验观察压力刺激对大鼠腧穴筋膜组织成纤维细胞力感受器分子integrinα1、integrinα2、α3和integrinαV表达的影响〔11〕，为针推的力学信号生物传递机制提供实验依据。

PCNA〔12〕于1978年由Miyachi等在系统性红斑狼疮(SLE)患者的血清中首次发现并命名，因其特异的“增殖性”而得名，只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内，静止状态的细胞基本不表达，其免疫反应大多局限于增殖细胞的核中，胞质则很少甚至没有。PCNA是目前测试细胞增殖状态最有效的标志之一。它的表达合成与增殖细胞的增殖周期有关，G0期细胞核中无明显表达，G1早期开始表达，至G1晚期其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显减少，其表达、分布与量的变化和DNA合成一致，几乎参与DNA所有的修复过程，对DNA复制的调节起不可取代的作用。细胞增殖是机体的重要生命特征之一，是机体生长、发育、繁殖和遗传的基础，而应力刺激是调控细胞增殖能力的重要因素之一，能够调节细胞新陈代谢〔13〕。有相关报道证实针刺介导的机械刺激可以增强细胞的“活力”:围刺穴位局部可使其成纤维细胞活性增强从而达到抗皮肤老化的作用〔14〕;通过结合Brud掺入法和免疫荧光法观察对筋膜结缔组织施予拉伸刺激针刺可以显著提高细胞的增殖活性〔15〕。

本研究结果显示，不同规格毫针刺激对腧穴筋膜结缔组织integrinβ1亚基的表达情况均有不同程度的影响。无论是否针刺刺激，刺激量不管大还是小，筋膜结缔组织细胞中integrinβ3亚基的表达始终呈阴性结果。

综上实验结果，其针灸学意义可能是:①β1类integrins是以筋膜结构组织为主的穴位针刺机械信号力学感受的主要分子途径。②β3类integrins不是以筋膜结构组织为主的穴位针刺机械信号力学感受的主要分子途径，但有可能是以血管为主的穴位针刺机械信号力学感受的主要分子途径。③在以β1类integrins为主的穴位筋膜结缔组织中，integrinβ1亚基感受有可能存在不同的表现方式，对轻中度刺激强表达，对重刺激弱表达，这可能是integrinβ1亚基感受存在敏感阈值范围，大体以中等强度刺激为佳。④毫针针刺能够提高受治腧穴穴区局部组织的细胞PCNA表达量，进一步揭示了针刺刺激信号通过细胞integrins感受后能激发细胞本身功能状态的改变，但PCNA表达量大小与刺激强度呈反向趋势，说明针刺信号感受与效应见存在复杂的量-效关系，而这有待于进一步研究。

4　参考文献

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〔2015-01-26修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者:陈波(1974-)，男，教授，硕士生导师，博士，主要从事针灸推拿的基础与临床运用研究。

基金项目:国家自然科学基金项目(No．81160456)

〔中图分类号〕R245.3