西格列汀对2型糖尿病鼠血清及不同组织视黄醇结合蛋白4的影响

戚仁娟　胡红琳　夏　莉　刘炯炯　王长江　方朝晖

·基础医学·

西格列汀对2型糖尿病鼠血清及不同组织视黄醇结合蛋白4的影响

戚仁娟胡红琳夏莉刘炯炯王长江方朝晖

[摘要]目的研究西格列汀对2型糖尿病大鼠血清及不同组织视黄醇结合蛋白4(RBP4)表达水平的影响。方法将35只SD大鼠随机分为两组，即对照组(NC，n=10)和高脂组(HF，n=25)。12周后，HF组大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素35 mg/kg，成功建立2型糖尿病模型大鼠20只，并随机分为糖尿病对照组(DM组，n=10)和西格列汀干预组(SP组，n=10)。分别测定干预前后体质量(BW)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰岛素(FINS)及血清RBP4水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)。Western Blot法检测大鼠不同组织RBP4蛋白表达水平。结果①与NC组相比，DM组、SP组BW、FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOM A-IR、RBP4升高，HOMA-β降低，差异有统计学意义(P<0.05)；西格列汀干预后，SP组较DM组FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4降低，HOMA-β升高，差异有统计学意义(P<0.05)。② 与NC组相比，DM组附睾脂肪、肌肉组织RBP4蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与DM组相比，SP组附睾脂肪、肌肉组织RBP4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论2型糖尿病大鼠血清RBP4水平升高，附睾脂肪、肌肉组织RBP4蛋白表达水平增高。西格列汀能显著降低2型糖尿病大鼠血清RBP4水平及附睾脂肪、肌肉组织中RBP4蛋白表达水平。

[关键词]2型糖尿病；西格列汀；视黄醇结合蛋白4

作者单位： 230022合肥安徽医科大学第一附属医院内分泌科(戚仁娟，胡红琳，夏莉，刘炯炯，王长江)

230031合肥安徽中医药大学第一附属医院内分泌科(方朝晖)

2型糖尿病是世界范围内严重的公共卫生问题，严重危害民众健康，消耗大量社会资源之一。据估计，全球目前约有2.85亿2型糖尿病患者，且这个数字仍在不断增长[1]。2型糖尿病患者中80%为超重或肥胖，肥胖是胰岛素抵抗和高血糖的主要发病因素。视黄醇结合蛋白4(RBP4)是近年发现的由白色脂肪组织特异分泌的细胞因子，其在糖调节受损、糖尿病患者中明显高于健康对照组，并且随着病情进展血清RBP4进一步升高。RBP4作为新的脂肪因子，具有引起胰岛素抵抗(IR)的作用，参与一系列与IR相关的疾病，包括糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪肝的发生发展[2]。

西格列汀作为二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，具有刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制内源性葡萄糖的生成，达到降低血糖的作用，但西格列汀与2型糖尿病患者的RBP4的相关研究较少。本实验通过建立高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型，给予西格列汀干预，测定2型糖尿病大鼠干预前后血清RBP4水平及肝脏组织、附睾脂肪及肌肉组织RBP4蛋白的表达水平，分析西格列汀干预对RBP4的可能作用及作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物及饲料35只普通级4周龄雄性SD大鼠，体质量(100±20)g，购自安徽医科大学动物实验中心。普通饲料由安徽医科大学动物实验中心配制，为国家标准龋齿类动物固体混合饲料。高脂饲料配方为普通饲料55%，猪油12%，蔗糖5%，奶粉8%，花生5%，鸡蛋10%，麻油3%，食盐2%。

1.2实验试剂西格列汀(默沙东公司)，胰岛素放免试剂盒(北京原子高科公司)，链脲佐菌素(美国Sigma公司)，RBP4酶免试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)，稳豪血糖仪及试纸(美国强生公司)，RBP4一抗(英国Abcam公司)，RBP4二抗、β-actin一抗、β-actin二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3动物分组及2型糖尿病大鼠模型建立将35只大鼠予以普通饲料适应性喂养1 周后随机分为对照组(NC组,n=10)，予普通饲料喂养；高脂饲料组(HF组，n=25)，予高脂饲料喂养。两组大鼠平行饲养，自由饮水，室温21~24℃，相对湿度40%~60%，自然昼夜节律，2周称体质量1次。12周后，将HF组的大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(临用前溶解在pH=4.5的0.1 mmo/L柠檬酸缓冲液中)35 mg/kg，于注射后第7天内眦静脉取血测大鼠血糖，将空腹血糖大于11.1 mmol/L者定为糖尿病模型造模成功(n=20)[3]，并将其随机分为西格列汀组(SP组，n=10)和糖尿病对照组(DM组，n=10)。

1.4干预方法SP组给予西格列汀灌胃10 mg·kg-1·d-1，NC组及DM组均以等剂量生理盐水灌胃，共干预6周，干预期间NC组继续普通饮食，DM组及SP组继续高脂饮食。

1.5标本采集及检测糖尿病模型造模成功后，所有大鼠禁食12 h，内眦静脉取血2 mL，干预6周后，所有大鼠禁食12 h，称体质量，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射，麻醉状态下腹主动脉取血3 mL，血标本静止15 min后，3 200 r/min离心10 min，留取血清置于-80 ℃冰箱保存。麻醉状态下解剖大鼠，冰上操作取出肝脏组织、附睾脂肪及肌肉组织，置于液氮罐中以备提取蛋白质。血糖仪纸片法测定血糖，Roche Modular全自动生化分析仪测定血脂，放免法测定胰岛素，ELISA法测定血清RBP4，采用HOMA-IR模型公式计算胰岛素抵抗指数[HOMA-IR=FINS(mIU/L)×FBG(mmol/L)/22.5]，胰岛β细胞功能指数(HOMO-β)表示胰岛β细胞功能强度[HOMO-β=20×FINS/(FBG-3.5)][4]。

1.6Western Blot提取肝脏组织中的总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度决定上样量。依次进行电泳、转膜、封闭，RBP4兔抗一抗(1 ∶500)4 ℃孵育过夜后，辣根酶标记的山羊抗兔二抗(1 ∶4 000)室温下孵育2 h。充分洗涤后加入ECL化学发光剂，暗室显影成像。检测后的膜重新用TBST清洗3次，TBS清洗1次(10 min/次)，重复上述步骤进行内参照β-actin(一抗1 ∶1 000稀释，二抗1 ∶4 000稀释)的结合。采用上述相同方法，在相同条件下完成附睾脂肪、肌肉组织RBP4及对应的β-actin蛋白检测。RBP4蛋白相对表达量以其特异性结合条带与β-actin结合条带的灰度值比值表示。

2结果

2.1干预前各组大鼠代谢指标比较与NC组相比，DM组、SP组大鼠体质量(BW)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)升高，胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)降低，差异有统计学意义(P<0.05)，DM组、SP组两组间各指标差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

±s)

注：与NC组比较：*P<0.05

2.2干预后各组大鼠代谢指标比较西格列汀干预6周后，SP组大鼠的FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR下降，HOMA-β升高，与DM组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。西格列汀干预后，与DM组相比，SP组大鼠体质量有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

±s)

注：与NC组比较，*P<0.05；与DM组相比，#P<0.05

2.3干预前后各组大鼠血清RBP4水平比较干预前，DM、SP组大鼠血清RBP4水平升高，与NC组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，DM组、SP组两组间比较差异无统计学意义。西格列汀干预后SP组血清RBP4水平下降，与干预前相比，差异有统计学意义(P< 0.05)，与DM组相比，差异有统计学意义(P< 0.05)，但仍高于NC组(P<0.05)。详见表3。

±s)

注：与NC组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05

2.4Western Blot结果

2.4.1肝脏组织中RBP4蛋白的表达与NC组相比，DM组RBP4蛋白表达水平有升高趋势，但差异无统计学意义；与DM组相比，SP组RBP4蛋白表达水平有降低趋势，但差异亦无统计学意义。见图1(A、D)。

2.4.2附睾脂肪RBP4蛋白的表达与NC组相比，DM组RBP4蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与DM组相比，SP组RBP4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图1(B、D)。

2.4.3肌肉组织RBP4蛋白的表达与NC组相比，DM组RBP4蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与DM组相比，SP组RBP4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图1(C、D)。

A：肝脏组织中RBP4蛋白的表达；B：附睾脂肪中RBP4蛋白的表达；C：肌肉组织中RBP4蛋白的表达；D：不同组织中RBP4蛋白表达水平的统计学分析，与NC组比较，*P<0.05，与DM组相比，#P<0.05

3讨论

RBP4是新近被发现的作用于肌肉和肝脏，并影响胰岛素敏感性的脂肪因子。RBP4主要由肝脏、脂肪及肌肉组织合成，它可以将视黄醇从肝脏转运至各种靶组织[5]。当RBP4在脂肪组织表达过多时可导致葡萄糖转运体-4(GLUT-4)表达下降，抑制肝脏和肌肉组织对葡萄糖的利用[6]。RBP4水平的升高与胰岛素抵抗的发生密切相关，RBP4导致胰岛素抵抗的机制为RBP4水平升高可使肝脏产生过多的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PECK)，导致糖异生增加，并且通过IRS-1和PI3K等途经导致肌肉组织胰岛素信号传导减弱[2, 7, 8]。减轻体质量及锻炼能够降低2型糖尿病患者中的RBP4水平，RBP4水平的降低与胰岛素抵抗的改善密切相关[8]。降低RBP4水平也许能够成为治疗2型糖尿病的一种新方法[4]。

本实验结果显示，2型糖尿病大鼠血清RBP4水平及附睾脂肪、肌肉组织RBP4蛋白表达水平较正常对照组升高，且以附睾脂肪RBP4蛋白表达水平增高为主，肝脏组织中RBP4表达量较正常对照组无明显改变，这提示RBP4虽然主要由肝脏、脂肪和肌肉组织合成，但在高血糖状态下，血清中增高的RBP4水平可能主要来源于脂肪组织。

目前，关于西格列汀对2型糖尿病大鼠RBP4蛋白表达有无影响的相关报道较少。本实验通过给予2型糖尿病大鼠西格列汀干预6周来观察RBP4蛋白表达水平的变化，实验结果表明西格列汀干预后，血清RBP4水平及附睾脂肪、肌肉组织RBP4蛋白表达水平下降，且糖脂代谢明显改善，与Derosa等[4]在2型糖尿病患者中的研究结果类似。西格列汀降低RBP4蛋白表达水平的机制目前尚不完全明确，可能因为降低了空腹血糖和胰岛素，改善胰岛素抵抗，RBP4适应性下调。另有研究[9]表明，GLP-1干预后糖尿病模型鼠脂肪组织GLUT4表达水平增加，而RBP4水平与GLUT4水平呈负相关[10]，随着GLUT4表达水平增加，RBP4表达水平下降。因此推测，西格列汀干预后RBP4表达水平下调与体内GLP-1浓度增加，GLUT-4表达水平增加亦有关。经西格列汀干预后，SP组大鼠体质量虽有下降趋势，但差异无统计学意义，与Hemmeryck等[11]在糖尿病鼠中的研究结果一致，原因可能为西格列汀干预过程中继续高脂饮食，且西格列汀并未影响大鼠的食物摄入量，抑或与干预时间有关。

综上所述，2型糖尿病大鼠血清及附睾脂肪、肌肉组织中RBP4水平升高，RBP4在肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生发展过程中扮演着重要的角色。西格列汀干预后能显著降低2型糖尿病大鼠血清及脂肪组织、肌肉组织RBP4表达水平。

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(2014-11-08收稿2015-01-07修回)

Effects of sitagliptin on serum and different tissues retinol binding protein 4 expression levels in a rat model of type 2 diabetes

mellitus

QiRenjuan,HuHonglin,XiaLi,etal

DepartmentofEndocrinology，theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022，China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effects of sitagliptin on metabolic parameters, serum retinol binding protein 4 (RBP4) levels, liver, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 expression levels in a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM). MethodsTirty-five Sprague Dawley rats were randomly divided into normal diet group (NC group) of 10 rats and high fat diet group (HF group) of the remaining 25. After being fed on a high fat diet for 12 weeks, the HF group was given the peritoneal injection of a low dose of streptozotocin 35 mg/kg, and a rat model of T2DM (n=20) was established and randomly divided into two groups: diabetic control group (DM group,n=10), sitagliptin group (SP group,n=10). Body weight (BW), fasting blood glucose (FBG), triglyceride (TG), total cholesterol (TCH), low-density lipoprotein (LDL-C), fasting insulin (FINS), serum RBP4 were measured respectively before and after the 6 weeks of treatment, and homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IR), homeostasis model assessment β-cell function index (HOMA-β) were calculated. The liver, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels were detected by Western blot. Results①The levels of BW, FBG, TG, TCH, LDL-C, FINS, HOMA-IR and serum RBP4 in DM group and SP group increased while the levels of HOMA-β decreased compared with those of NC group with a statistical significance (P<0.05). After treatment with sitagliptin, the levels of FBG, TG, TCH, LDL-C, FINS, HOMA-IR and serum RBP4 of SP group decreased while the levels of HOMA-β increased compared with those of DM group with a statistical significance (P<0.05). ② Epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels in DM group increased compared with those in NC group, and epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels in SP group decreased compared with those in DM group. ConclusionSerum, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein levels are elevated in a rat model of T2DM. Sitagliptin can lower serum, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein levels in a rat model of T2DM.

[Key words]Type 2 diabetes mellitus; Sitagliptin; Retinol binding protein 4

通信作者：胡红琳，hhlin1994@sina.com

基金项目：安徽中医学院中医药管理局重点学科—中医内分泌学科开放基金(2011nfmxk004)；安徽省高校省级自然科学研究项目(KJ2013Z126)；安徽医科大学第一附属医院2011年度国家自然科学基金青年科学基金培养计划(2011KJ11)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.001