DPP-4抑制剂通过Nrf2/HO-1/P21信号通路抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制研究

柯 蕊,和 平,张永红,张 伟,刘 原

(西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:liuyuan@mail.xjtu.edu.cn)

肺动脉高压(pulmonary hypertension)是一类常见的肺血管疾病,表现为静息状态下肺动脉压力升高,同时合并不同程度右心功能衰竭。肺动脉高压在全球发病率为1%,在老龄化超过65岁的人群中可达到10%,严重危害着全球人类健康[1]。目前临床上治疗肺动脉高压的靶向药物副作用多、治疗费用昂贵,导致肺动脉高压治疗的依从性大大降低,给肺动脉高压的治疗带来新的挑战。

二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制剂主要通过促进胰岛素分泌,增高葡萄糖耐量,降低胰岛素抵抗,被用于2型糖尿病的治疗。最近的研究表明,DPP-4抑制剂还具有心血管保护作用,如改善血管内皮功能、降低血管平滑肌细胞增殖、抑制心肌细胞凋亡、减轻血管炎症反应等[2]。进一步研究提示DPP-4抑制剂的心血管保护作用与激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor-2, Nrf2)/血红素加氧酶1(hemeoxygenase-1, HO-1)信号通路有关[3-5]。在肺动脉高压的研究中也发现,DPP-4抑制剂可抑制肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖,降低动物模型的肺动脉压力并逆转肺血管重塑,提示DPP-4抑制剂可能成为肺动脉高压治疗的潜在药物[6,7]。然而,DPP-4抑制剂是否通过Nrf2/HO-1通路发挥抑制PASMCs增殖的作用,目前尚未见报道。本研究通过5-HT刺激原代PASMCs增殖,探讨DPP-4抑制剂是否抑制5-HT诱导的PASMCs增殖,并探讨其中的分子机制,以期为防治肺血管重塑及肺动脉高压的策略提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠由西安交通大学医学部实验动物中心提供;DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;ML385、SnPP购自美国Sigma公司;西格列汀购自默沙东制药有限公司;BrdU细胞增殖检测试剂盒购自中国上海麦约尔生物技术有限公司;Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;大鼠P21 siRNA购自中国上海吉玛制药技术有限公司;兔抗大鼠α-SM-actin单克隆抗购自英国Abcam公司;FITC标记的山羊抗兔IgG购自中国中杉金桥生物技术公司;兔抗大鼠Nrf2、HO-1、P21单克隆抗体购自美国CST公司;兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体、HRP标记抗兔二抗购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠PASMCs的培养及鉴定 4周龄SD大鼠,体质量70-80 g,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,取出大鼠心脏和肺脏组织,在无菌条件下分离出肺动脉,钝性刮去内、外膜,将剩余血管中膜剪切成约1 mm×1 mm大小组织块,均匀摆置于细胞培养瓶底,加20% FBS-DMEM培养基,于37 ℃、5% CO2培养,待大部分组织块长出细胞晕,并与相邻组织块的细胞晕呈亚融合状态时可进行传代。应用抗α-SM-actin免疫荧光染色鉴定其纯度,确保血管平滑肌细胞纯度≥90%。取第3-6代PASMCs接种于含10% FBS-DMEM培养基,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 BrdU掺入法检测细胞增殖 5-HT是一种重要的促细胞有丝分裂原。我们前期研究已发现1 μmol/L 5-HT可明显刺激PASMC增殖[8]。为明确西格列汀对PASMCs增殖的影响,将PASMCs分为对照组、5-HT组、不同浓度西格列汀(2.5,5,10,20,40 μmol/L)+5-HT组。对照组不进行任何处理,5-HT组加入1 μmol/L 5-HT刺激24 h,不同浓度西格列汀+5-HT组在加入5-HT前分别用2.5,5,10,20,40 μmol/L西格列汀预处理30 min,应用BrdU试剂盒检测各组细胞增殖情况并筛选西格列汀作用浓度。为研究西格列汀是否通过Nrf2/HO-1/P21信号通路抑制PASMCs的增殖,将PASMCs分为对照组、5-HT组、西格列汀+5-HT组,Nrf2抑制剂ML385+西格列汀+5-HT组,HO-1抑制剂SnPP+西格列汀+5-HT组,P21 siRNA转染+西格列汀+5-HT组。对照组、5-HT组、西格列汀+5-HT组处理同前,ML385+西格列汀+5-HT组及SnPP+西格列汀+5-HT组在加入1 μmol/L 5-HT前用西格列汀分别联合5 μmol/L ML385或10 μmol/L SnPP预处理30 min,P21 siRNA转染+西格列汀+5-HT组预先转染P21 siRNA 24 h后联合西格列汀,再加入1 μmol/L 5-HT作用24 h后,采用BrdU掺入法检测各组细胞增殖情况。以上每组设6个复孔。终止细胞培养前8 h加入BrdU继续培养,随后固定细胞、变性DNA、清洗细胞,加入BrdU抗体培养细胞,再次清洗细胞后加入辣根过氧化物酶标记的二抗培养,清洗细胞后加入TMB底物显色,加入反应终止液后用分光光度计测量细胞的吸光度,吸光度的强弱与插入细胞DNA中的BrdU量成正比,从而反映出DNA合成(细胞增殖程度)。

1.2.3 细胞转染 采用Lipofectamin 2000试剂盒转染P21 siRNA。待细胞至60%融合,用不含血清的DMEM培养液分别稀释P21 siRNA和Lipofectamin试剂,混合后室温培养20 min后加入细胞,继续培养48 h,提取细胞总蛋白,应用Western blot检测p21基因沉默效果,以上实验重复3次。

1.2.4 Western blot检测细胞Nrf2、HO-1及P21的蛋白水平 为研究在PASMCs中西格列汀是否上调Nrf2及HO-1的蛋白表达,PASMCs给予20 μmol/L西格列汀刺激24 h,应用Western blot检测细胞中Nrf2及HO-1的蛋白水平。为研究在PASMCs中西格列汀是否通过Nrf2/HO-1上调P21,PASMCs分为对照组、5-HT组、西格列汀+5-HT组、ML385+西格列汀+5-HT组及SnPP+西格列汀+5-HT组处理同前,应用Western blot检测各组细胞中P21蛋白水平。细胞收集并使用裂解缓冲液提取细胞总蛋白,采用BCA法检测蛋白浓度。将蛋白定量后95 ℃煮沸10 min变性制样,取等量蛋白上样。运用SDS-PAGE聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳进行蛋白分离,浓缩胶中电压80 V,分离胶中电压120 V,直至溴酚蓝接近分离胶的底端停止电泳。含20%的甲醇转印液转印置(100 V,2 h)至PVDF膜上。缓冲液TBST涮洗,5%脱脂牛奶或5% BSA室温下封闭2 h,缓冲液TBST洗膜5 min×3次,加入稀释后Nrf2、HO-1或P21一抗(1 ∶500稀释),4 ℃孵育过夜。缓冲液TBST洗膜5 min×3次,辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠、山羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀释),室温下孵育2 h,缓冲液TBST洗膜5 min×3次,ECL显色,采用Bio-rad成像系统检测条带,采集图像,采用Quantity One软件进行定量分析,以GAPDH为内参,计算目的蛋白相对表达量,以上实验重复3次。

1.3 统计分析

采用SPSS13.0统计软件,多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两组间比较用Tukey post hoc检验,重复测量数据行重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PASMCs的培养及鉴定

PASMCs呈多边形或梭形,部分融合时,可见典型的“峰-谷”样生长(见图1A)。应用抗α-SM-actin免疫荧光染色后,高倍镜下可见胞浆内大量与细胞长轴平行排列的绿色纤维细丝,鉴定为PASMCs(见图1B),其纯度>90%。

A.“峰-谷”样生长 (×100) B.细胞免疫荧光染色 (×100)图1 原代大鼠PASMCs的培养及鉴定Figure 1 Primary culture and identification of rat PASMCs

2.2 DPP-4抑制剂西格列汀可抑制5-HT诱导的PASMCs增殖

5-HT可明显促进PASMC增殖与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05,见图2),而预先给予西格列汀干预,PASMCs的增殖被不同程度逆转。西格列汀浓度为20 μmol/L时可明显抑制PASMC的增殖,细胞增殖率下降至对照组的1.35倍,与5-HT组相比,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。因此,我们在后续的实验中选择20 μmol/L西格列汀用于后续实验。

与对照组相比,*P<0.05;与5-HT组相比,#P<0.05图2 西格列汀对5-HT诱导PASMCs增殖的影响Figure 2 The effect of sitagliptin on 5-HT-induced PASMC proliferation

2.3 DPP-4抑制剂西格列汀可上调Nrf2及HO-1

20 μmol/L西格列汀作用24 h,Nrf2以及HO-1的蛋白表达量明显升高,与对照组相比分别增加2.06倍和1.99倍(P<0.05,见图3)。

与对照组相比,*P<0.05图3 西格列汀对Nrf2及HO-1蛋白表达的影响Figure 3 The effect of sitagliptin on the protein expression of Nrf2 and HO-1 in PASMCs

2.4 DPP-4抑制剂西格列汀通过Nrf2/HO-1上调P21

与对照组相比,5-HT组中P21蛋白表达量明显降低(P<0.05);西格列汀+5HT组中P21蛋白表达量高于5-HT组(P<0.05);ML385+西格列汀+5-HT组及SnPP+西格列汀+5-HT组中P21蛋白表达量均低于西格列汀+5HT组(均P<0.05,见图4)。

与对照组相比,*P<0.05;与5-HT组相比,△P<0.05;与西格列汀+5-HT组相比,#P<0.05图4 西格列汀可通过Nrf2/HO-1上调P21表达Figure 4 Sitagliptin upregulated P21 expression by Nrf2/HO-1 in PASMCs

2.5 DPP-4抑制剂西格列汀通过Nrf2/HO-1上调P21抑制PASMCs增殖

与对照组相比,5-HT组PASMCs增殖率明显升高(P<0.05);西格列汀+5HT组PASMCs增殖率低于5-HT组(P<0.05);ML385+西格列汀+5-HT组、SnPP+西格列汀+5-HT组及P21 siRNA+西格列汀+5-HT组PASMCs增殖率均高于西格列汀+5HT组(P<0.05,见图5)。

3 讨论

本研究发现,DPP-4抑制剂西格列汀可明显抑制5-HT诱导的PASMCs增殖,并上调Nrf2及HO-1的蛋白表达。进一步研究发现,DPP-4抑制剂西格列汀可逆转5-HT诱导的P21下调,而预先抑制Nrf2或HO-1可部分阻断西格列汀对P21表达的调控。最后,预先采用Nrf2或HO-1特异性抑制剂或P21 siRNA转染可逆转西格列汀对PASMCs增殖的抑制作用。以上研究结果提示,DPP-4抑制剂西格列汀可通过激活Nrf2/HO-1信号通路,上调细胞周期抑制蛋白P21,进而抑制PASMCs增殖。本研究证实了DPP-4抑制剂对PASMCs增殖的抑制作用以及潜在机制,为研发新的靶向治疗药物提供了思路。

与对照组相比,*P<0.05;与5-HT组相比,△P<0.05;与西格列汀+5-HT组相比,#P<0.05图5 西格列汀通过Nrf2/HO-1上调P21,从而抑制PASMCs增殖Figure 5 Sitagliptin inhibited PASMC proliferation through Nrf2/HO-1-mediated P21 upregulation

Nrf2是机体内一个关键的核转录因子,参与多种细胞内防御机制相关的信号传导。研究发现,HO-1是Nrf2主要的下游靶分子之一[9,10]。在正常状态下,Nrf2与Nrf2的细胞质抑制剂Keap1结合,并被泛素-蛋白酶体途径降解;在受到外界刺激时,Nrf2从复合体中解离出来,并从细胞质转移到细胞核,与HO-1启动子抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)结合,激活HO-1基因表达,从而发挥细胞保护作用[9,10]。Nrf2/HO-1作为一条经典的抗氧化通路,除在调控抗氧化酶系的表达过程中发挥重要作用外,还具有抗炎、扩血管、改善组织微循环、抑制细胞增殖等多种生物学功能[9-11]。研究发现,DPP-4抑制剂可明显上调Nrf2的表达,并激活Nrf2,促进其下游基因HO-1及NQO1的表达,从而抑制血管平滑肌的增殖以及血管重塑的发生[3-5]。本研究也发现,DPP-4抑制剂西格列汀可明显上调Nrf2以及HO-1的表达,并抑制PASMCs的增殖;而预先抑制Nrf2或HO-1可抵消西格列汀对PASMCs增殖的抑制作用,提示DPP-4抑制剂西格列汀通过Nrf2/HO-1信号通路抑制PASMCs的增殖。

P21是负性细胞周期调节蛋白家族的重要成员之一,通过抑制cyclin D1-CDK4/CDK6复合物以及cyclin E-CDK2复合物的激酶活性,从而阻碍细胞从G1期进入S期,负向调控细胞周期的进行。研究发现在多种恶性肿瘤细胞中P21表达的降低,且与肿瘤的预后呈正相关[12]。上调P21的水平可抑制细胞周期的进展和细胞的增殖。研究发现,p21是HO-1的下游重要靶点之一,HO-1可通过上调P21的表达水平抑制哺乳动物细胞增殖[13,14]。本研究发现,细胞有丝分裂原5-HT可明显下调P21的表达并促进PASMCs的增殖;DPP-4抑制剂西格列汀可逆转5-HT诱导的P21下调以及PASMCs增殖,而预先抑制Nrf2或HO-1可抵消西格列汀对P21的上调以及对PASMCs增殖抑制作用。以上结果提示DPP-4抑制剂通过激活Nrf2/HO-1信号通路上调P21的表达,从而促进PASMCs的增殖。

肺动脉高压是一种常见的临床综合征,目前的治疗药物虽在一定程度上降低了患者的肺动脉阻力和压力,但这些药物常伴有较明显的不良反应,且治疗费用极为昂贵。DPP-4抑制剂是一种口服降糖药,因其安全、稳定的降糖效果及对心血管系统保护作用而受到内分泌专家的青睐。近年来的研究表明,DPP-4抑制剂除具有降血糖作用外,还可以降低多种肿瘤的发病率以及逆转血管增殖性疾病的血管重塑[2,15]。本研究发现DPP-4抑制剂西格列汀可抑制PASMCs的增殖,提示DPP-4抑制剂可能成为治疗肺动脉高压的潜在药物。但目前DPP-4抑制剂在肺动脉高压中的治疗作用仍处于临床前研究阶段,DPP-4抑制剂治疗肺动脉高压的有效性、安全性及最佳治疗剂量等问题仍需进一步的试验来验证。