直肠癌组织中Id-2和MMP-9的表达与临床病理学指标的关系

单铁英，单铁强，岳 峰，袁 征，王 芳，王雪丹，郑海萍，董永杰，周进朝，李桂英△

（1.河北工程大学医学院基础医学系，河北邯郸056002；2.河北省秦皇岛市海港医院检验科 066000；3.河北省邯郸市中心医院普外科，河北邯郸056002；4.河北省邯郸市永年县第二医院普外科 056002）

直肠癌是我国消化道肿瘤中最为常见的恶性肿瘤之一，其发生率仅次于胃癌和食管癌，近年来由于人们的饮食结构发生变化，它的发病率有逐年增高的趋势，同时发病年龄也趋向年轻化，因此对于直肠癌的发生发展的研究引起广大医学者的兴趣。研究表明，分化抑制因子2（inhibitors of differentiation 2，Id-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达水平与直肠癌的发生发展存在着密切的关系。本研究主要观察在人直肠癌组织中Id-2和MMP-9的表达情况，分析两者表达水平的相关性，探讨直肠癌临床病理学指标与两者表达水平的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年1月1日至2011年9月1日来自邯郸市中心医院经手术切除的原发性直肠癌组织标本56例，其中男44例，女12例。年龄33～75岁，中位年龄55岁。所有标本中均以直肠癌组织的中心组织为直肠癌组织，以距癌肿5cm 的组织为癌旁正常组织。根据第7版肿瘤TNM 分期（国际抗癌联盟和美国癌症联合会合作制订），对直肠癌进行分期：56例患者中，11例为Ⅰ期，15 例为Ⅱ期，17 例为Ⅲ期，13例为Ⅳ期。采用2000年WHO 标准对直肠癌组织学分型：33例为高、中等分化，23例为低等分化。24例患者有淋巴结转移，32例患者无淋巴结转移。所有断端组织均未发现癌细胞。所有病例取材前均未接受化学治疗及放射治疗。上述患者均无异常病史如糖尿病及糖耐量等。患者的标本经病理科确诊。

1.2 主要试剂 鼠抗人Id-2、鼠抗人MMP-9多克隆抗体以及SP免疫组织化学试剂盒均购自北京中衫金桥生物有限公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 结果判定标准

1.3.1 Id-2染色结果的判断 Id-2阳性细胞表示为：细胞质呈现出染色为棕黄色的细颗粒。结果的判断以阳性细胞数的多少和细胞染色强度的高低为依据并采用半定量积分的方法来表示，染色强度计分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；阳性细胞数所占的比例计分：0分为无阳性细胞，1 分 为 小 于 或 等 于25%，2 分 为26%～50%，3 分 为51%～75%，4分为大于或等于76%。上述二者计分的乘积：阴性（-）为0分，弱阳性（＋）为1～3分，中阳性（＋＋）为4～8分，强阳性（＋＋＋）为9～12分。

1.3.2 MMP-9染色结果判定方法 结果判断MMP-9蛋白主要在细胞质表达，阳性染色为细胞质呈现出棕黄色或黄褐色的颗粒，根据染色细胞所占细胞总数的百分比计分：阴性（-）为无细胞染色；弱阳性（＋）为阳性细胞数小于20%；中阳性（＋＋）为阳性细胞数21%～50%；强阳性（＋＋＋）为阳性细胞数大于50%。

1.4 统计学处理 采用SPSS14.0软件分析和处理数据，计数资料采用率表示，组间的比较采用χ2检验，两种蛋白的表达水平有无相关性采用Spearman相关分析法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Id-2 在各组织中的表达情况 在大部分直肠癌组织标本中可见Id-2着色呈棕黄或棕褐色，位于细胞质中，阳性细胞较多且呈弥散分布；癌旁正常组织标本中也可见着色，但是阳性细胞数较少且染色较浅呈浅黄色，散在分布于间质；癌旁正常组织中阳性表达极少（见图1）。在直肠癌组织和癌旁正常组织中Id-2的阳性表达率分别为73.21%和48.21%；在癌旁正常组织中Id-2的阳性表达率比在直肠癌组织的阳性表达率明显降低。经统计学分析其差异有统计学意义（χ2＝13.077，P＜0.05），见表1。

图1 Id-2 在癌旁正常组织及直肠癌中的表达（×400）

表1 Id-2 在直肠癌及癌旁正常组织中的表达

2.2 MMP-9 在各组织中的表达情况 在大部分直肠癌组织标本中可见MMP-9着色呈棕黄或者棕褐色，位于细胞质中，阳性细胞较多且呈弥散分布；癌旁正常组织标本中也可见着色，但是阳性细胞数较少且染色较浅呈浅黄色，散在分布于间质；癌旁正常组织中阳性表达极少（见图2）。在直肠癌组织和癌旁正常组织中MMP-9 的阳性表达率分别为71.43%和44.64%；在癌旁正常组织中的MMP-9阳性表达率比直肠癌组织的阳性表达率明显降低。经统计学分析其差异有统计学意义（χ2＝13.875，P＜0.05），见表2。

图2 MMP-9在癌旁正常组织及直肠癌中的表达（×400）

表2 MMP-9在直肠癌及癌旁正常黏膜中的表达

2.3 相关性分析 Spearman 相关分析表明Id-2 与MMP-9在癌旁正常组织和直肠癌组织中的阳性率存在正相关性（r＝0.393，P＝0.003），见表3。

表3 Id-2 和MMP-9在癌旁正常组织和直肠癌组织中表达的相关性

2.4 直肠癌的临床病理指标与肿瘤细胞中Id-2 和MMP-9蛋白表达水平的关系

2.4.1 直肠癌的临床病理指标与Id-2表达水平的关系 在56例直肠癌组织中Id-2的表达水平均升高，其中低分化组的Id-2阳性表达率（91.30%）明显高于中、高分化组（60.61%）；Ⅲ～Ⅳ期组（90.00%）明显高于Ⅰ～Ⅱ期组（53.85%）；有淋巴结转移组（91.67%）明显高于无淋巴结转移组（59.38%）。以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。但是在直肠癌组织中Id-2的阳性表达率与患者的性别、发病年龄之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 Id-2的表达与不同直肠癌临床病理因素的关系

2.4.2 直肠癌的临床病理指标与MMP-9表达水平的关系 在56例直肠癌组织中MMP-9的表达水平均升高，其中低分化组的MMP-9阳性表达率（86.96%）明显高于中、高分化组（60.61%）；Ⅲ～Ⅳ期 组（86.67%）明 显 高 于Ⅰ～Ⅱ期 组（53.85%）；有淋巴结转移组（87.50%）明显高于无淋巴结转移组（59.38%），以上差异均有统计学意义（P＜0.05）。但是在直肠癌组织中MMP-9的阳性表达率与患者的性别、发病年龄之间的差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表4 MMP-9的表达与不同直肠癌临床病理因素的关系

3 讨 论

Id-2是一种在细胞发育过程中广泛表达的转录调控因子，作为Id蛋白家族成员之一，它也具有螺旋-环-螺旋（helix-loophelix，HLH）的结构。Id-2分子参与细胞的生长、发育、成熟、分化及死亡等过程，还参与调控细胞周期的进程。随后发现在不同种类的组织发育与肿瘤发展中Id-2 蛋白表现出多种作用：如参与胚胎发生和器官形成，肿瘤的浸润、分化、侵袭转移行为及不良预后等功能［1-2］。目前已发现Id-2蛋白在多种恶性肿瘤组织如神经母细胞瘤［3］、乳腺癌［4］、鼻咽癌［5］、膀胱癌［6］中过表达，因此人们日益重视其在肿瘤发生发展中的作用及意义。本研究显示：直肠癌组织中Id-2的阳性表达率比癌旁正常组织的阳性表达率明显升高，两者比较差异有统计学意义，与上述文献的研究结果一致，表明Id-2的异常高表达可能与直肠癌的发生发展密切相关。

研究表明，有关Id-2蛋白与肿瘤的分化程度、肿瘤的侵袭和浸润、淋巴结转移和肿瘤的预后等的研究，其结果不完全相同，甚至还有矛盾的结果。Coppe等［7］研究表明Id-2蛋白表达增多能使肿瘤细胞变得更有侵袭性。Itahana等［8］在研究乳腺癌与Id-2表达的关系中发现，把Id-2基因导入SCp2鼠上皮细胞中后，细胞的增殖明显减慢。同时也发现在侵袭性高、分化低的乳腺癌细胞中Id-2 mRNA 的表达水平明显高于侵袭性低、分化高的乳腺癌细胞。Schindl等［9］应用免疫组织化学技术在早期宫颈癌组织中检测Id-2蛋白的表达水平，结果显示Id-2表达水平则与宫颈癌的预后无关。本研究结果也表明，Id-2在直肠癌组织的阳性表达率明显高于癌旁正常组织。在分化低、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移的直肠癌组织中Id-2的阳性表达率明显高于分化高、Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的直肠癌组织，而在年龄和性别方面Id-2的阳性表达率，差异无统计学意义（P＞0.05）。

MMP-9属于水解酶的一种，它能对细胞外基质和基底膜成分进行降解，导致肿瘤细胞侵袭到身体的其他部位，从而促进了肿瘤的发展。研究表明，MMP-9在许多肿瘤组织中，如颅内动脉瘤［10］、胃癌［11］、乳腺癌［12］等组织中均有不同程度的阳性表达。本研究结果表明：癌旁正常组织中MMP-9的阳性表达率明显低于其在直肠癌组织的阳性表达率；在分化低、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移的直肠癌组织中MMP-9的阳性表达率明显高于分化高、Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的直肠癌组织，而在年龄和性别方面MMP-9的阳性表达率，差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究还显示Id-2表达与MMP-9表达呈正相关，直肠癌与癌旁正常组织中Id-2蛋白表达及MMP-9蛋白表达均存在差异。同时还观察到Id-2与MMP-9的表达部位一致，提示直肠癌组织中Id-2高表达可能是通过MMP-9途径来实现对肿瘤侵袭转移起促进作用。可以推测，在肿瘤的演进发展过程中，Id-2与MMP-9的高表达起着协同作用。在直肠癌发生早期，Id-2基因已发生改变，使细胞恶性转化、细胞增殖、分化失控和侵袭转移，促进了肿瘤的发生发展，同时也可能促进MMP-9的转录和功能，MMP-9蛋白的表达也升高，对肿瘤细胞周围的基质和基底膜成分进行降解，从而增强肿瘤细胞侵袭转移能力，又进一步促进了肿瘤的发展。在这个过程中Id-2是通过何种信号途径来上调MMP-9水平，其机制尚不清楚，有待于进一步的研究。

总之，Id-2的异常高表达可能在直肠癌演变过程中对直肠癌细胞的生长和侵袭起着重要的作用，其机制可能是通过激活MMP-9的转录，从而促进MMP-9的表达，直接或间接地促进肿瘤细胞的侵袭作用。因此，Id-2可能为抗肿瘤治疗提供了新的靶点。

［1］ Norton JD.ID helix-loop-helix proteins in cell growth，differentiation and tumorigenesis［J］.J Cell Sci，2000，113（Pt 22）：3897-3905.

［2］ Onken MD，Ehlers JP，Worley LA，et al.Functional gene expression analysis uncovers phenotypic Switch in aggressive uveal melanomas［J］.Cancer Res，2006，66（9）：4602-4609.

［3］ Paolella BR，Havrda MC，Mantani A，et al.p53directly represses Id2to inhibit the proliferation of neural progenitor cells［J］.Stem Cells，2011，29（7）：1090-1101.

［4］ Wazir U，Jiang WG，Sharma AK，et al.The mRNA expression of inhibitors of DNA binding-1and-2is associated with advanced tumour stage and adverse clinical outcome in human breast cancer［J］.Anticancer Res，2013，33（5）：2179-2183.

［5］ Liu Z，Chen J，Luo W，et al.Overexpressed DNA-binding protein inhibitor 2as an unfavorable prognosis factor promotes cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44（6）：503-512.

［6］ Luo M，Li Z，Wang W，et al.Upregulated H19contributes to bladder cancer cell proliferation by regulating ID2expression［J］.FEBS J，2013，280（7）：1709-1716.

［7］ Coppe JP，Itahana Y，Moore DH，et al.Id-1and Id-2proteins as molecular markers for human prostate cancer progression［J］.Clin Cancer Res，2004，10（6）：2044-2051.

［8］ Itahana Y，Singh J，Sumida T，et al.Role of Id-2in the maintenance of a differentiated and noninvasive phenotype in breast cancer cells［J］.Cancer Res，2003，63（21）：7098-7105.

［9］ Schindl M，Oberhuber G，Obermair A，et al.Overexpression of Id-1protein is a marker for unfavorable prognosis in early-stage cervical cancer［J］.Cancer Res，2001，61（15）：5703-5706.

［10］ 门中华.VEGF 和MMP-9在颅内动脉瘤中的表达及临床意义［J］.细胞与分子免疫学杂志，2010，26（11）：1126-1128.

［11］ 陈健，齐菲，黄莹，等.MMP-9基因多态性与胃癌关系的研究［J］.现代预防医学，2013，40（12）：2329-2333，2336.

［12］ 夏庆安，付玉环，姜广建.HSG、MMP-2 和MMP-9 在乳腺癌组织中的表达及意义［J］.现代预防医学，2012，39（2）：323-324，327.