广西壮族人群骨桥蛋白基因的单核苷酸多态性研究＊

韦贵将，梁丽娜，罗桂飞，陆 潞，韦叶生，唐毓金，王俊利△

（右江民族医学院附属医院：1.检验科；2.桂西高发病防治实验中心，广西百色533000）

骨桥蛋白是由一种具有多种生物学活性的细胞黏附分子，其广泛分布于多种组织和细胞中。目前研究认为骨桥蛋白在细胞黏附、迁移、细胞存活、血管生成和浸润转移中起重要作用，与肿瘤等疾病的发生、发展密切相关［1-3］。近年来随着分子生物学及分子流行病学的不断发展，新的研究发现，骨桥蛋白基因存在多种功能性多态性位点，且这些多态性位点也可能参与甲状腺乳头状瘤、尿路结石和缺血性脑卒中等疾病的发展进程［4-6］。因此，准确分析骨桥蛋白基因单核苷酸多态性（SNP）在不同地区和不同人群中的分布，可以为基因多态性与某些疾病的发生、发展提供更多有力的研究数据。作者采用SNaPshot SNP分型技术检测150 例广西壮族人群骨桥蛋白基因rs11728697位点和rs9138位点的遗传SNP，并对比HapMap公布的4个人群（欧洲人群、非洲人群、日本人群和中国北京人群）的SNP 检测结果，分析不同人群骨桥蛋白基因的SNP 差异，为与骨桥蛋白相关的遗传和疾病等方面的研究提供参考资料。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2012年1月1日至2012年8月1日广西右江民族医学院附属医院进行常规体检的150名健康人为研究对象，其中男87名，女63名；年龄25～84岁，平均（52±15）岁，中位年龄40岁。纳入标准：3代世居广西的壮族人群；本人无恶性肿瘤史。实验经右江民族医学院附属医院伦理委员会批准，并在受试者本人知情同意后采集标本。

1.2 基因组DNA 的提取 抽取健康体检者静脉血2mL，使用碘化钠法提取细胞基因组DNA，低温保存待用。

1.3 PCR 反应 根据NCBI上查找的骨桥蛋白基因DNA 序列，选择包含rs11728697位点和rs9138位点的序列并输入引物设计软件Primer 5，得到用于特异性扩增包含rs11728697位点和rs9138位点骨桥蛋白基因的PCR 上下游引物和延伸引物。rs11728697位点的上游引物序列为：5′-AAC TGT GCC AGC CAA ACA ACA A-3′，下游引物序列为：5′-CCC TCC ACA CAC AAA CGA ACA C-3′，延伸引物序列为：5′-TTT TTT TTT TTG TTC AAT TCC AGT TGA ACA GAA TAA AGG-3′。rs9138位点的上游引物序列为：5′-GCA AAA TGA AAG AGA ACA TGA AAT GC-3′，下游引物序列为：5′-CTG GAC AAC CGT GGG AAA ACA A-3′，延伸引物序列为：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TAA GTG GGT AAA AGT ATT TTG TTT GC-3′。20μL 骨桥蛋白基因的PCR 扩增反应体系包括：10×PCR 反应缓冲液2.0μL，0.3 mmol／L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各1.0μL，HotStar Taq DNA 聚合酶1.0 U，基因组DNA 1.0μL，不足体积用水补足到20.0μL。PCR 产物4 ℃保存。PCR 反应 条 件 为：94 ℃15 min；94 ℃30s，60℃30s，72 ℃20s，共35个循环；72 ℃10min。

1.4 SNaPshot SNP分型技术 PCR 产物经过虾碱酶和外切酶Ⅰ纯化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶纯化后在ABI3130XL 上样。SNP分型用Gene Mapper 4.0（Applied biosystems）来分析。

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学处理，采用χ2检验，检验水准α＝0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨桥蛋白基因rs11728697位点和rs9138位点的检测结果 包含骨桥蛋白基因rs11728697 位点和rs9138 位点的PCR 扩增产物片段大小分别为185 bp 和428 bp。ABI 3130XL 的SNP 分型结果显示，rs11728697位点的基因型有CC、CT 和TT，基因分型结果如图1所示；rs9138位点的基因型有CC、CA 和AA，基因分型结果如图2所示。

2.2 骨桥蛋白基因SNP在广西壮族人群中的分布 在广西壮族人群中，骨桥蛋白基因rs11728697位点的CC基因型最常见，约为42.7%；C等位基因的频率最高，约为62.7%。rs9138位点的CA 基因型最常见，约为51.3%；C 等位基因的频率最高，约为63.0%。骨桥蛋白基因rs11728697位点基因型频率（χ2＝3.363，P＝0.162）和等位基因频率（χ2＝0.054，P＝0.816）男女组间比较差异无统计学意义，rs9138位点基因型频率（χ2＝0.048，P＝0.976）和等位基因频率（χ2＝0.008，P＝0.927）男女组间比较也差异无统计学意义。见表1、2。

2.3 广西壮族人群骨桥蛋白基因SNP 与其他4个人群的比较 广西壮族人群骨桥蛋白基因rs11728697位点的基因型和等位基因频率与欧洲人群、日本人群和非洲人群的差异有统计学意义（P＜0.05），而与中国北京人群的差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。rs9138位点的基因型和等位基因频率与欧洲人群和非洲人群的差异有统计学意义（P＜0.05），而与日本人群和中国北京人群的差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

图1 骨桥蛋白基因rs11728697位点SNP分型结果

图2 骨桥蛋白基因rs9138位点SNP分型结果

表1 rs11728697位点在广西壮族人群中的分布［n（%）］

表2 rs9138位点在广西壮族人群中的分布［n（%）］

表3 广西壮族人群骨桥蛋白基因rs11728697位点SNP与其他人群的比较［n（%）］

表4 广西壮族人群骨桥蛋白基因rs9138位点SNP与其他人群的比较［n（%）］

3 讨 论

骨桥蛋白是由一种具有多种生物学活性的细胞黏附分子，其化学本质为分泌型磷酸化糖蛋白，并广泛分布于多种组织和细胞中。骨桥蛋白基因位于4号染色体长臂，由6个内含子和7个外显子组成，编码由300个氨基酸残基组成相对分子质量约44×103的骨桥蛋白分子［7-8］。骨桥蛋白分子主要由信号肽序列、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构域和肝素结合结构域组成，它可以通过依赖性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸途径和非依赖性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸途径介导多种细胞生理功能［9-10］。目前研究认为骨桥蛋白在细胞黏附、迁移、细胞存活、血管生成和浸润转移中起重要作用，与肿瘤等疾病的发生、发展密切相关［1-3］。大量研究发现，非小细胞肺癌、乳腺癌和腺囊癌等多种肿瘤组织和患者血浆中都伴有骨桥蛋白表达水平明显升高，且骨桥蛋白的高表达与肿瘤恶性程度、转移程度呈正相关，患者预后差［11-15］。

近年来随着分子生物学及分子流行病学的不断发展，新的研究证实，骨桥蛋白基因存在多种功能性多态性位点，且这些多态性位点也可能参与甲状腺乳头状瘤、尿路结石和缺血性脑卒中等疾病的发展进程。Mu等［4］通过对363 例甲状腺乳头状瘤患者和413例健康人的骨桥蛋白基因SNP 检测发现，病例组rs11730582位点TT 基因型显著高于对照组，骨桥蛋白基因SNP与甲状腺乳头状瘤的易感性相关。Tugcu等［5］通过分析172例尿路结石患者和210 例健康人的骨桥蛋白基因SNP发现，骨桥蛋白基因rs1126616位点SNP 与尿路结石的发生风险具有相关性。而在Jing等［6］的报道中，通过分析中国人群骨桥蛋白rs11730582位点SNP，发现CT 基因型显著增加中国人群缺血性脑卒中的易感性。因此，准确分析骨桥蛋白基因SNP在不同国家或地区中的分布，可以为基因多态性与某些疾病的发生、发展提供更多有力的研究数据。本研究结果显示，骨桥蛋白基因型频率男女组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明此位点基因型分布与性别没有关系；广西壮族人群的基因型和等位基因频率与欧洲人群、非洲人群的差异明显，与日本人群和中国北京人群的差异无统计学意义（P＞0.05），表明此位点基因型和等位基因频率与人种有密切关系，即亲缘关系越近，基因型和等位基因频率越相近。

总之，本研究阐明了广西壮族人群骨桥蛋白基因rs11728697位点和rs9138位点的基因型和等位基因频率与性别无关，与亲缘关系远近相关。研究结果提供了广西壮族人群骨桥蛋白基因rs11728697位点和rs9138位点SNP分布，并对比了不同国家或地区人群骨桥蛋白基因的SNP 差异，为与骨桥蛋白相关的疾病研究提供了参考资料，也为人类学和群体遗传学补充了重要数据。

［1］ Qin L.Osteopontin is a promoter for hepatocellular carcinoma metastasis：a summary of 10years of studies［J］.Front Med，2014，8（1）：24-32.

［2］ 王丽，刘晓燕，李娟，等.骨桥蛋白抑制FHIT 表达促进结肠癌细胞增殖存活［J］.重庆医学，2012，41（34）：3583-3585.

［3］ 张岩，佟盛春，魏力.子宫内膜腺癌中OPN 和VEGF-C的表达及意义［J］.中国现代医学杂志，2013，23（33）：37-41.

［4］ Mu G，Wang H，Cai Z，et al.OPN-443C＞T genetic polymorphism and tumor OPN expression are associated with the risk and clinical features of papillary thyroid cancer in a Chinese cohort［J］.Cell Physiol Biochem，2013，32（1）：171-179.

［5］ Tugcu V，Simsek A，Tarhan T，et al.OPN gene polymorphism（Ala250）and lower serum OPN levels are associated with urolithiasis［J］.Ren Fail，2013，35（6）：825-829.

［6］ Jing M，Li B，Hou X，et al.OPN gene polymorphism and the serum OPN levels confer the susceptibility and prognosis of ischemic stroke in Chinese patients ［J］.Cell Physiol Biochem，2013，32（6）：1798-1807.

［7］ Young MF，Kerr JM，Termine JD，et al.cDNA cloning，mRNA distribution and heterogeneity，chromosomal location，and RFLP analysis of human osteopontin （OPN）［J］.Genomics，1990，7（4）：491-502.

［8］ Kiefer MC，Bauer DM，Barr PJ.The cDNA and derived amino acid sequence for human osteopontin ［J］.Nucleic Acids Res，1989，17（8）：3306.

［9］ Sivakumar S，Niranjali Devaraj S.Tertiary structure prediction and identification of druggable pocket in the cancer biomarker-Osteopontin-c［J］.J Diabetes Metab Disord，2014，13（1）：13.

［10］ Chen Q，Shou P，Zhang L，et al.An osteopontin-integrin interaction plays a critical role in directing adipogenesis and osteogenesis by mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2014，32（2）：327-337.

［11］ 蒋沛月，李晶华.宫颈癌患者化疗前后骨桥蛋白水平变化［J］.重庆医学，2014，43（1）：27-29.

［12］ Yu TT，Han ZG，Shan L，et al.Expression of osteopontin in non-small cell lung cancer and correlative relation with microvascular density ［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（1）：29-32.

［13］ Thorat D，Sahu A，Behera R，et al.Association of osteopontin and cyclooxygenase-2expression with breast cancer subtypes and their use as potential biomarkers［J］.Oncol Lett，2013，6（6）：1559-1564.

［14］ Fok TC，Lapointe H，Tuck AB，et al.Expression and localization of osteopontin，homing cell adhesion molecule／CD44，and integrin alphavbeta3in pleomorphic adenoma，polymorphous low-grade adenocarcinoma，and adenoid cystic carcinoma［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2013，116（6）：743-751.

［15］ Kwak TK，Sohn EJ，Kim S，et al.Inhibitory effect of ethanol extract of Ocimum sanctum on osteopontin mediated metastasis of NCI-H460non-small cell lung cancer cells［J］.BMC Complement Altern Med，2014，14（1）：419.