降钙素基因相关肽经鼻给药对大鼠脑梗死的预防和保护作用

吴庆建，闫承军，宋大庆，刘云海，孙树印

(济宁市第一人民医院急诊内科，山东 济宁 272011)



降钙素基因相关肽经鼻给药对大鼠脑梗死的预防和保护作用

吴庆建，闫承军，宋大庆，刘云海，孙树印※

(济宁市第一人民医院急诊内科，山东 济宁 272011)

摘要：目的探讨降钙素基因相关肽(CGRP)经鼻给药对大鼠局灶性脑梗死的保护能力，为脑梗死的治疗提供新思路。方法30只健康8周龄SD大鼠随机分为正常对照组、局灶性脑梗死组和实验组，各10只。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞脑缺血/再灌流模型；测定脑组织水、Na+含量；采用神经病理学评分标准进行神经功能评价；用TTC染色法观察鼠脑梗死部位和计算梗死体积。结果实验组脑组织含水量和Na+含量显著低于局灶性脑梗死组[(80.2±1.3)%比(85.4±1.3)%；(458±47) μmol/g比(590±39) μmol/g]，差异均有统计学意义(P<0.01)。实验组脑梗死体积和神经功能评分显著低于局灶性脑梗死组[(16.4±1.3)%比(43.4±5.1)%；(7.0±0.5)分比(26.7±4.2)分]，差异均有统计学意义(P<0.01)。 结论CGRP经鼻给药对大鼠局灶性脑梗死有预防和保护作用，对减轻脑水肿有良好的作用。

关键词：脑梗死；降钙素基因相关肽；脑水肿；经鼻给药

脑梗死由于其高致残率严重危害人类健康，脑水肿是脑梗死的严重并发症之一，是导致神经功能障碍的主要病理生理改变，严重威胁患者的生命[1]。降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)是第一个利用基因重组技术发现的由37个氨基酸组成的活性多肽，是目前发现最强的血管扩张剂[2]，广泛存在于神经组织，具有改善脑血流和保护神经的作用[3]。由于其相对分子质量较大，半衰期短，经静脉给药很难透过血脑屏障到达中枢神经系统。本研究在大鼠实验性脑梗死模型上经鼻靶向中枢导入CGRP，通过观察神经系统评分、梗死体积、脑组织含水量等指标变化，探讨经鼻预防给予CGRP对实验性脑梗死后脑水肿和脑损伤的预防和保护作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物和分组8周龄健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(购于济宁市鲁抗动物实验中心)，30只，SPF级，雌雄各15只，体质量200～240 g。经山东省动物检疫所检验合格，许可证号：SCCK(鲁)2013-0023。动物反应良好，无脱毛、断尾。30只大鼠随机分为3组，各10只。正常对照组：雌雄各5只，体质量为(218±4) g，不经任何处理；局灶性脑梗死组：雌雄各5只，体质量(220±5) g，经线栓法制作脑梗死模型，苦味酸(黄色)标记；实验组：雌雄各5只，体质量(217±6) g，预防给药，于模型制作成功后立即经鼻给药，品红(红色)标记。3组大鼠的性别、体质量等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2试剂和仪器CGRP：购自SIGMA，USA，批号：201211029。其余均为国产分析纯试剂，包括水合氯醛、75%酒精、甲醇、邻苯二甲醛、3-甲基组氨酸、多聚甲醛，均购自天津化学试剂三厂。纱布、尼龙线购自临沂市达三江好纤线业公司。体温计购自上海华辰医用仪表有限公司。微量注射器由香港友诚生物科技有限公司提供。

BL-620S电子天平购自日本岛津公司。电烤箱由东莞毕星机械有限公司提供。M3100型原子吸收分光光度计购自美国PE公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的制作参照Zea-longa的线栓法[4]，大鼠经水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，仰卧位固定于手术台上，75%的酒精消毒颈部皮肤，在手术显微镜下取颈正中切口，分离出右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，将顶端圆钝的4-0尼龙线从颈外动脉插入颈内动脉从而阻断大脑中动脉起始端。插入的尼龙线长度为(18.5±0.5) mm。大鼠大脑中动脉闭塞60 min后，将尼龙线缓慢退出至颈总动脉予以再灌注。在手术过程中，持续监测SD大鼠体温，通过肛表电热毯反馈装置将SD大鼠体温维持在37 ℃。

1.2.2给药方法麻醉大鼠后取仰卧位固定，头颈部用纱布垫高，以有利于药物进入后鼻腔。各组均于再灌流后，经鼻腔插入一根与微量注射器相连的5.0 cm长的PE-50号硅胶管，分别给予CGRP 1 μg (溶于50 μL媒介液中)，两侧鼻孔交替给药，当一侧鼻孔给药时，将大鼠的嘴及另一侧鼻孔封闭。每单次给药量为5 μL，间隔时间2 min，每只大鼠给予10次，20 min 内给予总量为50 μL的药液。

1.2.3脑组织水、Na+含量测定局灶脑梗死组和实验组均于模型建立后24 h快速断头处死大鼠后取出脑组织，用滤纸吸去表面鲜血，称湿重并记录后将脑组织置于烤箱中烘干，称出干重并记录，称重天平为 1/1000 g电子分析天平。脑组织含水量计算公式：(湿重-干重)/湿重×100%。采取原子吸收法计算Na+含量，在原子吸收分光光度计上直接测定，波长为589 nm。使用EDS软件处理数据，结果由计算机打印，单位为 μmol/g(干重脑组织)。

1.2.4脑梗死体积的测定将大鼠脑在冰浴上取出，-20 ℃冻存30 min，切成2 mm厚的连续切片。TTC常规染色，4%多聚甲醛固定，将TTC染色片扫描至计算机中，计算总的梗死体积及左右半球体积。为纠正脑水肿对梗死体积的影响，采用以下公式：梗死体积(%)=[左半球体积-(右半球体积-梗死体积)]/左半球体积×100%计算梗死体积。

1.2.5神经功能评分参照神经病理学评分标准[1]分别对每只动物用前肢放置实验、后肢放置实验和平衡木实验进行行为神经功能评分。

2结果

2.1CGRP对大鼠局灶性脑梗死后脑组织水、Na+含量的影响各组大鼠脑组织水含量、Na+含量比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中局灶性脑梗死组脑组织水含量、Na+含量高于正常对照组(P<0.01)，但实验组脑组织水含量、Na+含量低于局灶性脑梗死组(P<0.01)，见表1。

表1　CGRP对大鼠局灶性脑梗死后

a与正常对照组比较，P<0.01；b与局灶性脑梗死组比较，P<0.01

2.2CGRP对局灶性脑梗死体积和神经功能评分的影响各组大鼠梗死体积和神经功能评分比较差异均有统计学意义(P<0.01)，其中局灶性脑梗死组脑梗死体积和神经功能评分显著高于正常对照组(P<0.01)，但实验组脑梗死体积和神经功能评分显著低于局灶性脑梗死组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2　CGRP对局灶性脑梗死体积和

a与正常对照组比较，P<0.01；b与局灶性脑梗死组比较，P<0.01

3讨论

近十多年的研究已经证实，很多药物经鼻给药后能绕过血脑屏障进入脑脊液或脑组织而发挥治疗作用。经鼻给药具有无创、简便、靶向性强等优点，是一种全新的中枢神经系统给药途径。CGRP是由37个氨基酸残基组成的神经肽，广泛分布于周围神经系统、中枢神经系统和心血管系统，参与多种疾病的病理过程，是受到神经病学研究者高度重视的神经活性物质[5]，与心脑血管疾病的发生、发展密切相关[6]。但由于血脑屏障的存在，加之CGRP大分子特性，外源性的CGRP给药难以到达中枢神经系统发挥有效的血药浓度。研究表明，脑池内应用CGRP能逆转兔实验性脑血管痉挛[7]。有研究针对大鼠全脑缺血/再灌注模型采用经颈动脉注入CGRP的方法研究CGRP对脑组织神经细胞缺血性损伤的影响，脑组织切片染色发现CGRP对缺血后海马CA1的锥体细胞起到了保护作用[8]。脑内直接注射、经颈动脉注入作为侵入性操作，不可能成为常规的给药途径。刘新峰等[9]研究发现,胰岛素样生长因子经鼻给药可进入中枢神经系统并有效治疗实验性脑梗死。

经鼻给予CGRP对局灶性脑梗死所致脑水肿有显著的预防作用。Liu等[10]通过研究小鼠脑梗死模型认为，CGRP能减少动脉灌注压,梗死体积,脑水肿,血脑屏障通透性,水通道蛋白4 mRNA和水通道4蛋白表达。此外,CGRP还可改善毛细血管内皮细胞超微结构损伤，减少紧密连接后的损失,再灌注46 h后采用透射电子显微镜观察发现CGRP能显著减少脑水肿。本研究结果显示，实验组大鼠脑组织含水量和Na+含量低于局灶性脑梗死组(P<0.01)，与Liu等[10]的研究结果一致。此外，CGRP还能延缓脑梗死对胃黏膜的破坏作用。Feng等[11]研究了30例健康成年雄性小鼠，分为CGRP治疗组和对照组。结果显示，CGRP能调节胃泌素、生长抑素、水通道蛋白4和成纤维细胞生长因子的分泌,肥大细胞退化，从而减轻脑梗死对胃黏膜的破坏。

经鼻给予CGRP对局灶性脑梗死具有显著的预防作用。Holland等[12]研究静脉内灌注CGRP[100 ng/(kg·m)] 5 h后认为，脑梗死小鼠脑部血流和脑损伤体积明显好转。实验组缺血性脑血流为(32±2) mL/(100 g·min)，对照组为(13±2) mL/(100 g·min)(t=6.92,P<0.01)；实验组缺血性脑损伤容积 为(102±22) mm3，对照组为(234±19) mm3(t=4.47,P<0.01)，从而延缓了局灶性脑梗死。本研究结果显示，实验组脑梗死体积和神经功能评分显著低于局灶性脑梗死组，差异有统计学意义(P<0.01)，也从另一个角度验证了Holland等[12]的研究结果。内皮素是迄今已知作用较强的缩血管因子，广泛分布于中枢神经系统，其缩血管和促血管平滑肌细胞增生的作用强大，与CGRP有强烈持久的拮抗效应[13]。缺血缺氧、缺血/再灌注损伤都可以促进内皮素大量释放，其强烈缩血管作用导致缺血缺氧加重。研究表明[13]，脑梗死的病理生理过程与内皮素和CGRP比例失衡有关，直接作用于神经细胞，导致细胞内Ca2+浓度升高，神经元功能发生不可逆的损伤。CGRP具有有拮抗内皮素的作用，对脑血流的调节起关键作用[14]，可以减少炎性渗出、抑制炎性介质的微血管反应[15]，从而发挥脑保护作用。为拮抗脑梗死后内皮素的缩血管效应，内源性CGRP被耗损，若中枢神经系统损伤区获得较高浓度的外源性CGRP，可大大提高脑保护作用[16]。

本研究结果表明，经鼻靶向中枢给予CGRP可以有效降低脑梗死大鼠脑组织含水量、Na+含量，减轻脑梗死后脑水肿。局灶性脑梗死组和实验组大鼠行为神经评分显著优于正常对照组，但实验组上述指标均低于局灶性脑梗死组(P<0.01)。

综上所述，经鼻经鼻靶向中枢给予CGRP可有效避开血脑屏障，进入脑损伤区发挥神经保护作用，显示出对脑梗死的确切治疗效果，说明对大鼠局灶性脑梗死有预防和保护作用。但其具体机制仍待进一步研究。

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Preventive and Protective Effect of Intranasal Delivery of Calcitonin Generelated Peptide on Cerebral Infarction in RatsWUQing-jian，YANCheng-jun，SONGDa-qing，LIUYun-hai，SUNShu-yin.(DepartmentofEmergencyMedicine,JiningFirstPeople′sHospital，Jining272011，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the protective effect of intranasal administration of calcitonin gene related peptide(CGRP) effects on focal cerebral infarction in rats,in order to provide a new way of treatment for cerebral infarction.MethodsA total of 30 healthy SD rats aged 8 weeks were randomly divided into the normal control group,the focal cerebral infarction group,and the experimental group,with 10 rats in each group.The middle cerebral artery occlusion(MCAO)/reperfusion model of the rats was made by nylon strand.Contents of water and sodium in the brain were detected.The neurological function was evaluated according to neuropathological criteria.The volume of cerebral infarction and its location were determined by TTC staining.ResultsContents of water and Na+in brains of the experimental group were significantly lower than those of of the focal cerebral infarction group [(80.2±1.3)% vs (85.4±1.3)%；(458±47) μmol/g vs (590±39) μmol/g],the differences were statistically significant(P<0.01).The volume of cerebral infarction and neurological score of the experimental group were significantly lower than those of the focal cerebral infarction group [(16.4±1.3)% vs (43.4±5.1)%；(7.0±0.5) scores vs (26.7±4.2) scores], the differences were statistically significant(P<0.01).ConclusionIntranasal administration of CGRP has definite preventive and protective effect on focal cerebral infarction in rats.It also has good effects of inhibition of brain edema.

Key words:Cerebral infarction; Calcitonin generelated peptide; Cerebral edema; Intranasal administration

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-03-04编辑：伊姗

基金项目：2010年济宁市科技局立项课题(济科字〔2010〕85号-24)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.054

中图分类号：R361.2

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)11-2064-03