电针三阴交、阴陵泉对腓肠肌损伤大鼠损伤后修复及生长因子表达的影响

连晓阳，陈少清，方忆生，王诗忠，林建平

电针三阴交、阴陵泉对腓肠肌损伤大鼠损伤后修复及生长因子表达的影响

连晓阳，陈少清，方忆生，王诗忠，林建平

[摘要]目的探讨电针治疗腓肠肌损伤的可能机制。方法30只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为空白组(n=10)、模型组(n=10)和电针组(n=10)。模型组和电针组采用腓肠肌钝挫伤的方法制备模型，电针组电针三阴交、阴陵泉穴14 d。治疗结束后取腓肠肌组织行HE染色，免疫组化法检测大鼠腓肠肌组织、ELISA法检测大鼠血清碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)的表达。结果与模型组相比，电针组损伤程度较轻，腓肠肌组织bFGF、IGF-1表达明显升高(P<0.01)，血清含量升高(P<0.05)。结论电针可以促进腓肠肌损伤大鼠损伤后修复，其机制可能与上调修复因子bFGF和IGF-1的表达水平有关。

[关键词]腓肠肌损伤；电针；碱性成纤维细胞生长因子；胰岛素样生长因子-1；大鼠

[本文著录格式]连晓阳，陈少清，方忆生，等.电针三阴交、阴陵泉对腓肠肌损伤大鼠损伤后修复及生长因子表达的影响[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(11): 1273-1276.

CITED AS: Lian XY, Chen SQ, Fang YS, et al. Effects of electroacupuncture at Sanyinjiao and Yinlingquan acupoints on muscle repair and expression of growth factors in gastrocnemius muscle damaged rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(11): 1273-1276.

肌肉骨骼系统损伤是意外伤害中发病率最高的一类损伤[1]，腓肠肌损伤在剧烈活动的运动员中尤为常见[2]。有研究表明，电针三阴交等穴可促进腓肠肌损伤的修复[3-4]，但其机制尚未完全阐明。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是FGF家族成员之一[5]，在FGF家族中，抗组织损伤和促进修复方面作用最强[6]；胰岛素样生长因子-1 (insulin-likegrowth factor-1, IGF-1)是一类广谱性促生长因子[7]，对骨骼肌的生长、分化起重要作用[8]。b-FGF和IGF-1均是肌肉损伤修复过程中的重要因子。本研究观察电针三阴交、阴陵泉穴对腓肠肌损伤后组织和血清中bFGF及IGF-1表达的变化，探讨电针三阴交、阴陵泉穴治疗腓肠肌损伤的可能机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

清洁级8周龄健康Sprague-Dawley雄性大鼠30只，体质量(200±20) g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCK(沪)2012-0002。

1.1.2仪器

DM IL LED倒置显微镜：LEICA仪器有限公司。Multiskan MK3全自动酶标仪、Heraeus PICO 17低温高速离心机：美国THERMO公司。G-6805华佗牌电针仪：上海华谊仪器厂。

1.1.3试剂

兔抗bFGF、IGF-1抗体：博奥森公司。DAB显色剂：迈新生物技术公司。bFGF、IGF-1酶联检测试剂盒：上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组

大鼠实验前适应性饲养1周。将大鼠编号，随机数字表法分为空白组(n=10)、模型组(n=10)和电针组(n=10)。

1.2.2造模

采用钝挫腓肠肌建立大鼠腓肠肌损伤模型[9]。模型组和电针组大鼠术前禁食12 h，禁水4 h。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。剪除大鼠右下肢腓肠肌处皮毛。大鼠俯卧位，保持踝关节跖屈90°，使腓肠肌位于胫腓骨内侧。标记腓肠肌肌腹中点。打击器质量500 g，由48 cm处自由落下，垂直打击标记部位，打击器与腓肠肌接触面积约1×1 cm，动能为2.352 J。连续打击3次。

1.2.3干预

电针组参考《实验针灸学》等[10-11]取大鼠三阴交和阴陵泉穴，应用华佗牌G-6805电针仪，予疏密波，频率2/10 Hz，电流强度2 mA，以右后肢出现轻微颤抖为准。每次30 min，每天1次，连续14 d，从造模后第1天开始治疗。

空白组、模型组置于普通笼中饲养，不做任何处理。

1.2.4 HE染色

治疗14 d后，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，锐性切取右后肢腓肠肌肌腹中段的病灶组织约1×1 cm。生理盐水冲洗，4%多聚甲醛溶液漂洗，4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，石蜡包埋，切片厚5 μm。二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，苏木素和伊红染色，光镜下观察组织结构变化。

1.2.5免疫组化染色

将固定满意的腓肠肌标本制成石蜡切片(方法同上)。60°烤片1 h，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，蒸馏水冲洗、热修复抗原，PBS冲洗封闭，一抗4℃孵育过夜，加二抗、三抗、DAB显色，大量自来水冲洗。苏木素复染、盐酸分色，PBS返蓝，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察、采集图像。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。高倍镜下(200倍)取5个视野，测量其平均光密度值(MD)。

1.2.6 ELISA

10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠仰卧固定在解剖台上，经腹主动脉取血4 ml。4℃4000 r/min离心10 min，取上清液于EP管中，-20℃保存备测。

从酶联检测试剂盒取出包被有抗bFGF或IGF-1特异抗体的酶标板，每孔加入标准品和待测大鼠血清100 μl，37℃温育30 min。洗涤液洗板5次，吸水纸拍干，加入生物素化抗大鼠bFGF或IGF-1抗体100 μl，37℃温育30 min。洗涤液洗板5次，吸水纸拍干，加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素100 μl，37℃温育30 min。洗涤液洗板5次，吸水纸拍干，每孔加入TMP显色液100 μl，37℃避光显色15 min。每孔加入终止液50 μl。15 min内在450 nm测定OD值；据样品OD值在标准曲线上查出其浓度。

1.3统计学分析

应用SPSS18.0软件进行统计学处理。各组数据以(xˉ±s)表示。符合正态分布，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)；不符合正态分布，采用多组样本秩和(Kruskal-Wallis)检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1HE染色

模型组肌纤维排列紊乱，可见大量破裂肌纤维，炎细胞浸润明显，肌纤维肿胀伴有透明样变性，肌纤维明显坏死。电针组肌组织内瘀血、水肿、出血灶大部分消失，血管增生，胶原纤维增生，与正常软组织相比较已基本恢复正常；新生肌纤维排列整齐，炎症基本吸收。空白组未见病理改变(图1)。

2.2免疫组化染色

与空白组相比，模型组腓肠肌组织中bFGF和IGF-1表达水平上升(P<0.05)。与模型组相比，电针组腓肠肌组织中bFGF和IGF-1表达水平明显上升(P< 0.01)。见图2、图3、表1。

图1　各组大鼠腓肠肌病理改变(HE染色，200×)

图2　各组大鼠腓肠肌bFGF表达(免疫组化染色，200×)

图3　各组大鼠腓肠肌IGF-1表达(免疫组化染色，200×)

2.3ELISA

与空白组相比，模型组血清中bFGF和IGF-1含量明显上升(P<0.01)。与模型组相比，电针组血清中bFGF和IGF-1含量上升(P<0.05)。见表2。

表2　各组血清bFGF、IGF-1水平(ng/ml)

3　讨论

肌肉损伤在所有运动损伤中约占10%～55%[12]，钝挫伤是常见的损伤类型之一[1]。损伤的肌肉通常可以通过肌肉再生进行修复，但不能完全恢复其结构和功能[13]。

现代研究已证实，电针能促进骨骼肌肌卫星细胞的增殖与分化，进而促进腓肠肌损伤的修复[14-15]。中医认为，脾主肌肉，肌肉疾病皆可从脾入手。三阴交、阴陵泉均为脾经要穴。本研究显示，电针三阴交、阴陵泉可以促进腓肠肌损伤大鼠损伤后修复。与其他研究结果一致[3,16]。

FGF是目前已知最大的生长因子家族之一[17]。bFGF是重要的有丝分裂促进因子，也是形态发生和分化的诱导因子，在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程[18]。Xu等研究表明，bFGF能促进失神经腓肠肌的肌卫星细胞增殖，延缓肌纤维萎缩和抑制肌纤维结缔组织增生[19]。张朝研究发现，bFGF在损伤后7 d内阳性表达呈现上升趋势，并在7～14d达到峰值[20]。冯鑫等研究发现，外源性bFGF可以降低损伤肌肉组织中波形蛋白的特异性表达及肌肉组织纤维化程度，促进肌肉损伤后结构及功能的恢复[21]。同时，bFGF可以促进肌肉拉伤后结蛋白表达，提高肌肉再生能力[22]。

IGF-1是一类广谱的促生长因子，化学结构与胰岛素原类似[23]。在骨骼肌的增殖阶段，IGF-1可以增加卫星细胞的增殖和分化。

IGF-1对肌肉再生的调节由多信号通路介导。IGF-1与其受体的α亚基结合后，可使β亚基自身磷酸化，激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。MAPK通路可将信号传至核内，启动与细胞增殖有关的靶基因转录，发挥促进细胞增殖、浸润和转移的效应[24]。

IGF-1可通过IGF-1受体发挥生长激素的局部效应。IGF-1受体位于细胞浆内，部分具有酪氨酸激酶活性功能，可刺激肌纤维对氨基酸的利用，促进蛋白质合成；还可抑制蛋白质的降解，从而提高蛋白质的净增率[25]。

因此，IGF-1可通过调控细胞增殖，增加蛋白质合成，减少蛋白质降解等途径促进骨骼肌损伤后的修复与再生。

本研究表明，电针在一定程度上可以上调腓肠肌组织和血清中bFGF和IGF-1的表达，这可能是电针促进腓肠肌损伤后修复的机制之一。

综上所述，电针三阴交、阴陵泉可促进腓肠肌损伤后修复，其作用机制可能与上调bFGF和IGF-1在腓肠肌组织和血清中表达水平有关。

由于腓肠肌损伤的机制复杂，以及电针多靶点的综合作用，其确切机制还需要进一步深入研究。

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·综述·

Effects of Electroacupuncture at Sanyinjiao and Yinlingquan Acupoints on Muscle Repair and Expression of Growth Factorsin GastrocnemiusMuscleDamaged Rats

LIANXiao-yang, CHENShao-qing, FANGYi-sheng, WANGShi-zhong, LINJian-ping
Fujian University of Traditional ChineseMedicine, Fuzhou, Fujian350122, China

Abstract:ObjectiveTo investigatetheeffectsof electroacupunctureat Sanyinjiao (SP6) and Yinlingquan (SP9) on musclerepair in the gastrocnemiusmuscledamaged ratsand itspossiblemechanism. Methods30 male Sprague-Dawley ratswererandomly divided into blank group (n=10), model group (n=10) and electroacupuncture group (n=10). The latter 2 groups were modeled with gastrocnemius muscle crush injury. Theelectroacupuncturegroup received electroacupunctureat Sanyinjiao and Yinlingquan for 14 days. Their gastrocnemiuswas observed with HE staining, and theexpressionsof basic fibroblast growth factor (bFGF) and insulin-likegrowth factor-1 (IGF-1) in gastrocnemius tissues and the serum were determined with immunochemical assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with the model group, there was less damage in the electroacupuncture group, with more expression of bFGF and IGF-1 in tissues (P<0.01) and serum (P<0.05). Conclusion Electroacupuncture can promote muscle repair after gastrocnemius muscle damage in rats, whichmay berelatedtotheincreaseof thebFGFand IGF-1expressioningastrocnemiustissueandserum.

Keywords:gastrocnemiusmuscledamage; electroacupuncture; basicfibroblast growthfactor; insulin-likegrowthfactor-1; rats

(收稿日期：2015-08-02修回日期：2015-08-31)

作者简介：作者单位：福建中医药大学，福建福州市350122。连晓阳(1990-)，男，汉族，福建三明市人，硕士研究生，主要研究方向：脊柱疾病康复的基础与临床研究。通讯作者：林建平(1985-)，女，汉族，福建福州市人，硕士，医师，主要研究方向：脊柱疾病康复的基础与临床研究。E-mail: 283959283@qq.com。

基金项目：1.国家自然科学基金项目(No.81303017)；2.校管课题重点学科专项(No.X2014081-学科)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.008

[中图分类号]R685

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2015)11-1273-04