养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区超微结构及p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白表达的影响

伞云琨，张晋霞，刘斌，刘颖，李世英

养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区超微结构及p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白表达的影响

伞云琨，张晋霞，刘斌，刘颖，李世英

[摘要]目的观察养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区超微结构及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表达的影响。方法180只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、血管性痴呆模型组(模型组)和养血清脑颗粒治疗组(治疗组)，采用改良的Pulsinelli四血管阻断法制作血管性痴呆模型，分别在术后1、2、4、8周采用透射电镜观察大鼠海马CA1区超微结构变化，免疫组化法和Western blotting法检测海马CA1区p38MAPK水平。结果模型组海马CA1区神经元大量固缩，细胞核溶解，异染色质边集，线粒体肿胀。治疗组海马CA1区神经元核膜较完整，核染色质分布较均匀，胞质内线粒体及其他细胞器基本正常。与假手术组相比，模型组各时间点p38MAPK蛋白表达明显增多(P<0.01)，4周时达高峰；与模型组比较，治疗组各时间点p38MAPK蛋白表达明显减少(P<0.01)。结论养血清脑颗粒可改善血管性痴呆模型大鼠海马CA1区损伤的神经元超微结构，可能与抑制p38MAPK蛋白的表达有关。

[关键词]血管性痴呆；养血清脑颗粒；p38丝裂原活化蛋白激酶；超微结构；大鼠

[本文著录格式]伞云琨，张晋霞，刘斌，等.养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区超微结构及p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(11): 1245-1250.

CITED AS: San YK, Zhang JX, Liu B, et al. Effect of YangxueQingnao Granuleon ultrastructuresand expression of p38 mitogen activated protein kinases in CA1 area of hippocampus of vascular dementia rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(11): 1245-1250.

血管性痴呆(vascular dementia, VD)是发生在脑血管疾病基础上的以记忆、认知功能缺损为主，或伴有语言、视觉空间技能及情感或人格障碍的获得性智力的持续性损害[1-2]。我们在前期血管性痴呆相关研究的基础上[3-8]，进一步探讨血管性痴呆的治疗机制。

海马结构是与学习、记忆等高级神经活动有关的重要部位，是对脑缺血最敏感的部位之一。血管性痴呆大鼠海马CA1区细胞超微结构发生破坏[9]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是重要的信号转导通路。p38MAPK是MAPK信号通路的重要成员，与血管性痴呆的发生和发展密切相关[10-11]。

中药养血清脑颗粒具有滋阴养血、平肝潜阳、活血通络的功效[12]。临床应用养血清脑颗粒能明显改善血管性痴呆患者认知功能和日常生活能力[13]。但其具体作用机制尚不明确。

本研究观察养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马CA1区超微结构及p38MAPK蛋白表达的影响，探讨养血清脑颗粒治疗血管性痴呆疾病的可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

清洁健康雄性Sprague-Dawley大鼠180只，月龄2～3个月，体质量250～300 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号SCXK(京)2013-0013。在华北理工大学屏障环境动物实验室自由进食喂养，室温(23±2)℃，自然光照。实验前适应喂养2周。

1.2主要试剂与仪器

养血清脑颗粒，国药准字Z10960082，批号130366：天津天士力制药股份有限公司。兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗体：北京博奥森生物公司。DAB显色液：北京中杉生物有限公司。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子质量标准蛋白。

低温离心机：SIGMA公司。电凝仪：张家港市航天医疗电器有限公司。切片机：上海亿欣生物科技有限公司。日立H-7650电子显微镜。

1.3动物分组

大鼠编号，用随机数生成器抽取不同数字，将大鼠分为假手术组、血管性痴呆模型组(模型组)和养血清脑颗粒治疗组(治疗组)，在模型制备成功后再随机分为造模术后1周、2周、4周和8周4个亚组，每个亚组15只大鼠，其中3只用于电镜检测，6只用于免疫组织化学检测，6只用于Westernblotting检测。

1.4模型制备

采用改良Pulsinelli四血管阻断法(4-VO)制备大鼠痴呆模型。大鼠术前8～12h禁食，4h禁水。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠俯卧位固定，常规消毒，沿背侧颈正中切开，逐层钝性分离，暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm的电凝针灼烧翼小孔中的椎动脉，造成永久性闭塞。大鼠仰卧位固定，腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，以细线穿线备用。24 h后，大鼠仰卧位固定，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，每次5 min，间隔10 min，共夹闭3次。局部伤口缝合前，滴庆大霉素预防感染。术后放回笼中常规饲养观察。

假手术组仅分离双侧颈总动脉，不做其他处理。

1.5给药方法

各组均灌胃给药，每天1次。假手术组、模型组予生理盐水10 ml/kg，治疗组将养血清脑颗粒用蒸馏水配置成混悬液(浓度0.32 g/ml)，每天10 ml/kg灌胃[14]。

1.6电镜观察

大鼠喂养至相应时点，脊髓脱臼法处死大鼠后立即断头，按《大鼠脑立体定位图谱》在冰盘上分离出大鼠海马CA1区。冠状切厚1 mm薄片，4℃下2.5%戊二醛-1.5%多聚甲醛固定1 d。1%锇酸固定，脱水，包埋，切超薄切片。透射电镜下观察神经元超微结构，摄相。

1.7免疫组织化学检测

大鼠喂养至相应时点，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，心腔灌注固定后断头取脑，取视交叉至乳头体组织，切片，包埋。在切片机上连续切片，厚5 μm，置60℃烤箱烘烤备用。60℃烤片30 min，取出后脱蜡水化；3%过氧化氢室温25 min封闭内源性过氧化物酶活性。枸橼酸高压热修复，冷却。血清封闭10 min后滴加稀释p38MAPK抗体一抗(1∶200)，放入湿盒，4℃冰箱过夜；滴加生物素化二抗37℃孵育1 h后DAB显色。苏木素复染，盐酸酒精分化后，封片。光镜下观察，p38MAPK蛋白染色呈棕黄色颗粒，位于胞浆内。高倍镜下选取6个不重叠的视野，行p38MAPK蛋白阳性细胞计数，取平均数。

1.8Westernblotting

大鼠喂养至相应时点，脊髓脱臼法处死后立即断头于冰上取脑，将取出的组织置于15 ml离心管中，加入组织裂解液，30 min后用组织匀浆机12000 r/min匀浆，细胞悬液4℃12000r/min离心10min，取上清液-80℃保存。蛋白定量后分装，PBS调蛋白浓度至800 μg/ml，加入等体积上样缓冲液，沸水煮至少5 min。冷却至室温，放入4℃冰箱备用。取蛋白样品60 μg，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸铵凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，以半干转转膜至NC膜，室温封闭至少1 h。加抗p38MAPK抗体(1∶500)，4℃冰箱孵育过夜。加稀释羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃反应2 h，ECL显色，暗室胶片曝光显影，ImageJ分析。

1.9统计学分析

所得数据以(xˉ±s)表示，用SPSS17.0软件处理。两组间比较采用t检验；多组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。显著性水平α= 0.05。

2　结果

5只由于病情过重淘汰，另有3只死亡。均予补充。

2.1电镜观察

假手术组海马CA1区神经元结构完整，核形态规则，核膜完整，核内染色质分布均匀，核仁清晰，胞质内细胞器丰富，线粒体无肿胀，嵴清晰可见，可见溶酶体、粗面内质网(图1)；模型组神经元大量固缩，细胞核溶解，异染色质边集，胞质内线粒体等细胞器肿胀明显，内质网扩张、空泡化，1～8周逐渐加重(图1)。治疗组神经元核膜较完整，核内染色质分布较均匀，胞质内线粒体及其他细胞器结构基本正常，偶见少量染色质凝集，线粒体轻度肿胀(图1)。

2.2免疫组化染色

假手术组海马CA1区可见少量p38MAPK蛋白表达。模型组各时间点与假手术组相比，p38MAPK蛋白表达明显增多(P<0.01)，4周时达高峰。治疗组各时间点与模型组比较，p38MAPK蛋白表达明显减少(P< 0.01)。见表1、图2。

表1　各组海马CA1区p38MAPK蛋白阳性细胞数

2.3Westernblotting

假手术组可见少量p38MAPK蛋白表达。与假手术组相比，模型组各时间点p38MAPK蛋白表达明显增多(P<0.01)。与模型组比较，治疗组各时间点p38MAPK蛋白表达明显减少(P<0.01)。见表2。

表2　各组海马CA1区p38MAPK蛋白表达

图1　各组大鼠海马CA1区神经元超微结构(8000×)

图2　各组大鼠海马CA1区p38MAPK表达(免疫组化染色，400×)

3　讨论

慢性脑缺血是血管性痴呆发生的主要病因之一[15]。本研究采用4-VO法制作血管性痴呆大鼠模型，24 h后反复用动脉夹夹闭造成脑缺血，是目前国内外公认的理想的血管性痴呆动物模型，已被广泛用于血管性痴呆治疗的研究。血管性痴呆模型制作成功的标准已在我们先前的研究中报道[15]。

海马是与学习记忆等高级神经活动有关的重要核团，参与脑内信息存储及记忆功能；CA1区与空间辨别及学习记忆关系最为密切[16]。研究发现，海马区缺血性病变是血管性痴呆的重要病理基础[9,17]。本研究显示，血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元发生明显结构异常，而养血清脑颗粒可改善海马CA1区损伤，起到对神经元的保护作用，从而改善血管性痴呆大鼠的认知功能。

MAPK为一组以级联方式依次活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内信号传递的交汇点，可将细胞外信息传递至细胞核，直接调节转录因子活性，调控基因表达，广泛存在于各种动物细胞内，对于细胞周期和基因表达具有重要调控作用[18-19]。p38MAPK是MAPK家族的主要成员之一，位于胞质内。p38 MAPK磷酸化后形成P-p38MAPK，产生一系列生物学效能，参与细胞增殖、分化，在炎性反应、休克、细胞凋亡等方面发挥重要作用[20-22]，与脑缺血损伤及血管性痴呆的发生和发展有密切关系[10-11,23]。

本研究显示，血管性痴呆大鼠海马CA1区p38MAPK蛋白表达增多，4周时达高峰。与文献报道结果一致[11,18]，说明p38MAPK信号通路在血管性痴呆的发生、发展过程中扮演着重要角色。

养血清脑颗粒主要由川芎、当归、白芍、钩藤、熟地黄、鸡血藤、决明子、夏枯草、细辛、延胡索、珍珠母组成，在改善软脑膜微循环、增加脑血管量、减轻脑损伤等方面具有显著效果[24]。养血清脑颗粒具有养血活血、平肝潜阳的作用，标本兼治，符合中医治疗血管性痴呆的要求。作为现代中药复方制剂，养血清脑颗粒具有多靶点、多环节、整体性调节机体的特点。文献报道，养血清脑颗粒能抑制神经细胞凋亡，保护神经元缺血性损害[25-26]。本研究显示，养血清脑颗粒可抑制p38MAPK的表达。

综上所述，养血清脑颗粒可保护血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元，可能与抑制p38MAPK蛋白的表达有关，进而改善血管性痴呆大鼠的认知功能。

[参考文献]

[1] Liu B, Tang J, Zhang JX, et al. Autophagy activation aggravatesneuronal injury in thehippocampusof vascular dementiarats[J]. Neural Regen Res, 2014, 9(13): 1288-1296.

[2] Pennisi G, Ferri R, Cantone M, et al. A review of transcranial magnetic stimulation in vascular dementia [J]. Dement Geriatr Cogn Disord, 2011, 31(1): 71-80.

[3]姜敏,刘斌.脑卒中患者认知障碍研究进展[J].中国康复医学杂志, 2010, 25(3): 289-292.

[4]刘斌,唐静,袁敏,等.血管性痴呆大鼠海马CA1区自噬及微管相关蛋白1轻链3的表达[J].第二军医大学学报, 2013, 34(9): 940-945.

[5]袁敏,刘斌,唐静,等. Beclin-1与Bcl-2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达及意义[J].天津医药, 2013, 43(11): 1092-1094.

[6]刘金霞,马原源,刘斌,等.微管相关蛋白1轻链3Ⅱ与微管相关蛋白2在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达[J].中国康复理论与实践, 2015, 21(5): 497-500.

[7]刘斌,毛文静,马原源,等.参芎化瘀胶囊对血管性痴呆大鼠海马CA1 区BDNF表达的影响[J].山东医药, 2011, 51(5): 24-26.

[8]刘斌,马原源,毛文静,等.参芎化瘀胶囊对血管性痴呆模型大鼠海马CA1区细胞凋亡及Bcl-2，Bax蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2011, 17(6): 176-179.

[9]刘斌,马原源,毛文静,等.参芎化瘀胶囊对血管性痴呆模型大鼠海马CA1区超微结构的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2010, 9(12): 125-128.

[10] Munoz L, Ammit AJ. Targeting p38 MAPK pathway for thetreatment of Alzheimer'sdisease[J]. Neuropharmacology, 2010, 58(3): 561-568.

[11]王雪笠,吕佩源,郭宗成,等.血管性痴呆小鼠海马p38 MAPK mRNA表达特征的研究[J].中风与神经疾病杂志, 2008, 25(2): 168-170.

[12]张玲,褚扬,马晓慧,等.养血清脑颗粒的药理作用研究进展[J].医学综述, 2011, 17(5): 769-771.

[13]沈玉梅.养血清脑颗粒治疗血管性痴呆临床评价[J].药物与临床, 2012, 23(12): 1482-1483.

[14]陶涛,秦新月,徐广会.养血清脑颗粒对大鼠缺血再灌注损伤后轴突再生及RGMa表达的影响[J].第三军医大学学报, 2013, 35(70): 635-638.

[15]刘斌,唐静,袁敏,等.自噬在血管性痴呆发病中的作用研究[J].临床神经病学杂志, 2013, 26(6): 424-429.

[16] Holscher C. Time, spaceand hippocampal functions[J]. Rev Neurosci, 2003, 14(3): 253-284.

[17]柏华,谭晓坤,李清勇.阿尔茨海默病与血管性痴呆的磁共振成像和脑电图特征比较[J].中国康复理论与实践, 2014, 20(11): 1057-1059.

[18]刘斌,毛文静,李爱春,等.参芎化瘀胶囊对血管性痴呆大鼠海马CA1 区p38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2010, 16(8): 161-164.

[19]李国辉,王耀辉. p38信号通路与缺血性脑卒中[J].中华老年心脑血管病杂志, 2014, 16(7): 779-780.

[20]梁迎春,杨海燕,赵林,等. p38MAPK参与血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡机制研究及养血清脑颗粒的保护作用[J].中华临床医师杂志：电子版, 2014, 8(6): 1104-1108.

[21] Duarte S, Shen XD, Fondevila C, et al. Fibronectin-α4β1 interactions in hepatic cold ischemia and reperfusion injury: regulation of MMP-9 and MT1- MMP via the p38 MAPK pathway [J]. Am J Transplant, 2012, 12(10): 2689-2699.

[22]赵兰峰,郭社卫,安仰原,等.脑缺血预适应大鼠脑内p38丝裂原激活蛋白激酶磷酸化水平和蛋白表达量的测定[J].中国康复理论与实践, 2008, 14(9): 801-803.

[23] Kovalska M, Kovalska L, Pavlikova M, et al. Intracellular signaling MAPK pathway after cerebral ischemia-reperfusion injury [J]. Neurochem Res, 2012, 37(7): 1568-1577.

[24] Xiong L, Zhang JJ, Sun D, et al. Therapeutic benefit of Yangxue Qingnao Granuleon cognitiveimpairment induced by chronic cerebral hypoperfusioninrats[J]. Chin JIntegr Med, 2011, 17(2): 134-140.

[25]王宏英,刘磊,谭岩,等.养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马神经元的保护作用[J].中国老年学杂志, 2014, 34(15): 4261-4263.

[26]楼小亮,席秋江,胡雪勇,等.养血清脑颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经干细胞增殖分化的影响[J].中国神经精神疾病杂志, 2014, 40 (7): 394-399.

·专题·

Effect of Yangxue Qingnao Granuleon Ultrastructuresand Expression of p38 Mitogen Activated Protein Kinases in CA1Areaof Hippocampusof Vascular Dementia Rats

SANYun-kun, ZHANGJin-xia, LIU Bin, LIU Ying, LI Shi-ying
First Department of Neurology, theAffiliated Hospital of North ChinaUniversity of Scienceand Technology, Tangshan, Hebei 063000, China

Abstract:ObjectiveTo observetheeffect of Yangxue Qingnao Granuleon theultrastructuresand expression of p38 mitogen activated protein kinases(p38MAPK) in CA1 areaof hippocampusin vascular dementiarats. Methods180 Sprague-Dawley ratswererandomly divided into sham group, vascular dementia model group (model group) and Yangxue Qingnao Granule treatment group (treatment group). Thevascular dementiawasmodeled with modified Pulsineli'sfour-vessel occlusion. Theultrastructureof CA1 areawasobserved with transmission electron microscope, whiletheexpression of p38MAPK in CA1 areawasdetected with immunohistochemstry and Western blotting 1, 2, 4 and 8 weeksafter modeling. ResultsIn themodel group, pyknosis, nuclear dissolution, heterochromatin margination and mitochondriaswellingwerefoundinmost of theneuronsin CA1. Inthetreatment group, thedistributionof chromatinwaswell-proportioned, andmitochondrion and other organellewerenormal. In themodel group, theexpression of p38MAPK increased at each timepoint compared with the sham group (P<0.01), and peaked 4 weeks after modeling, and decreased in the treatment group compared with the model group (P< 0.01). Conclusion Yangxue Qingnao Granulecan improvetheultrastructureof neuronal in CA1 areaof hippocampusof vascular dementia rats, whichmay relatewiththeinhibitionof theexpressionof p38MAPK.

Keywords:vascular dementia; YangxueQingnao Granules; p38mitogenactivatedproteinkinases; ultrastructure; rats

(收稿日期：2015-07-26修回日期：2015-09-11)

作者简介：作者单位：华北理工大学附属医院神经内一科，河北唐山市063000。伞云琨(1989-)，女，汉族，河北唐山市人，硕士研究生，主要研究方向：脑血管病及认知障碍。通讯作者：刘斌，男，硕士，主任医师，教授，研究生导师。E-mail: liubintsh@126.com。

基金项目：1.河北省高等学校科学技术研究重点项目(No.ZH2012046)；2.河北省省级重大医学科研课题(No.zd2013087)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.11.002

[中图分类号]R743.3

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2015)11-1245-06