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高效液相色谱法测定注射用己酮可可碱中有关物质

2015-03-04杜碧莹

中国药业 2015年21期
关键词:茶碱咖啡因注射用

杜碧莹

(广东省广州市药品检验所,广东 广州 510160)

高效液相色谱法测定注射用己酮可可碱中有关物质

杜碧莹

(广东省广州市药品检验所,广东 广州 510160)

目的建立测定注射用己酮可可碱中有关物质的高效液相色谱(HPLC)法。方法色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse plus C8柱(250 mm× 4.6 mm,5 m),流动相A为甲醇-0.544%磷酸二氢钾溶液(3∶7),流动相B为甲醇-0.544%磷酸二氢钾溶液(7∶3)梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,,检测波长为272 nm。结果己酮可可碱与各杂质分离良好,与可可碱、茶碱、咖啡因在质量浓度0.4~5.0 g/mL范围内与峰面积呈良好线性关系,定量限分别为8.5,11.1,28.8,12.6 ng。结论该法专属性强、灵敏、准确,可用于注射用己酮可可碱有关物质的测定。

注射用己酮可可碱;有关物质;高效液相色谱法

甲基黄嘌呤衍生物己酮可可碱是外周血管抗张剂,可降低外周阻力,改善脑和四肢的血液循环,已作为血管抗张剂用于各种血管性疾病的治疗[1-2]。同时,己酮可可碱为磷酸二酯酶抑制药,能增加细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平,具有免疫调节和抗纤维化等药理作用[3]。注射用己酮可可碱的质量标准在国外药典及2010年版《中国药典》中均无收载,且注射用己酮可可碱的有关物质检查采用高效液相色谱(HPLC)法,但检查方法均不完善[4-5]。本研究中对注射用己酮可可碱的已知有关物质(可可碱、茶碱、咖啡因与己酮可可碱)在色谱系统中做了有效分离,建立通过外标法控制已知有关物质,不加校正因子的主成分自身稀释法控制未知有关物质,方法灵敏度高,可有效控制其产品质量。现报道如下。

1 仪器与试药

日本岛津LC-10AT型高效液相色谱仪(带DAD检测器);Agilent 1200型高效液相色谱仪。可可碱(批号为 101110-201001,纯度为99.9%)、茶碱(批号为100121-201104,纯度为100.0%)、咖啡因(批号为171015-201010,纯度为100.0%)、己酮可可碱(批号为100591-200501,纯度为100.0%)对照品均购于中国药品生物制品检定所;注射用己酮可可碱(广东阳江制药有限公司,批号为 130703 1);甲醇(色谱纯,Merck公司),水为Millipore超纯水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent Zorbax Eclipse plus C8柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为0.544%磷酸二氢钾溶液-甲醇(7∶3);流动相B为0.544%磷酸二氢钾溶液-甲醇(3∶7),梯度洗脱,0~6 min时 B为 14%,6~13 min时 B 14%→90%,13~30 min时 B为90%,30~38 min时B 90%→14%,38~43 min时B为14%;流速:1.0 mL/min;柱温:35℃;检测波长:272 nm;进样量:20 μL。结果各组分出峰顺序依次为可可碱、茶碱、咖啡因与己酮可可碱。己酮可可碱的保留时间约12 min,茶碱峰与咖啡因峰的分离度为4,咖啡因峰与己酮可可碱峰的分离度为23。色谱见图1。

2.2 溶液制备

取可可碱、茶碱、咖啡因与己酮可可碱对照品各适量,精密称定,加溶剂[0.544%磷酸二氢钾溶液-甲醇(1∶1)混合液]溶解并定量稀释制成每1 mL中各含2 μg的混合溶液,即得对照品溶液。取本品,精密称定,加溶剂定量稀释制成每1 mL中约含己酮可可碱1 mg的溶液,即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

破坏试验:为考察己酮可可碱可能的降解产物及色谱条件的选择性,采用酸、碱、紫外光照及氧化对己酮可可碱进行破坏性处理。结果表明,己酮可可碱对碱、氧化剂较不稳定,出现了明显的杂质峰,但与主峰均有良好的分离。色谱图见图2。

检测波长确定:用二极管阵列检测器对上述破坏性试验样品的检测表明,己酮可可碱降解产物的最大吸收波长约为272nm,见表1。

图1 含量测定高效液相色谱图

图2 破坏性试验高效液相色谱图

表1 破坏性试验结果

线性关系考察:取可可碱、茶碱、咖啡因及己酮可可碱对照品适量,分别制成每1 mL中各含0.4~5.0 μg的溶液进行测定,以峰面积(X)为横坐标、质量浓度(Y)为纵坐标进行线性回归,回归方程分别为 Y=0.000 015 534 7 X-0.014 976 5(r=0.999 99,n=6);Y=0.000 015 185 8 X+0.002 733 1(r=0.999 98,n=6);Y=0.000 017 248 5 X+0.018 274 2(r=0.999 99,n=6);Y=0.000 024 759 6 X+0.045 660 6(r=0.999 97,n=6)。结果表明,可可碱、茶碱、咖啡因及己酮可可碱质量浓度在0.4~5.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取系统适用性溶液,连续进样6次,结果可可碱、茶碱、咖啡因及己酮可可碱峰面积变化的 RSD分别为0.30,0.20,0.40和0.40(n=6),表明仪器精密度良好。

定量限确定:按信噪比(S/N)为10∶1计,可可碱、茶碱、咖啡因与已酮可可碱定量限分别为8.50,11.10,28.80,12.60 ng。

重复性试验:取同一样品,依法制备6份供试品溶液并测定含量。结果的 RSD为1.30%(n=6),表明方法重复性好。

稳定性试验:取样品适量,依法制备供试品溶液,于0,2,6,10,24 h时取样测定。结果的 RSD为1.80%(n=5),表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 有关物质检查

结果见表2。

3 讨论

检测波长选择时,由合成工艺可见,可可碱为反应原料,茶碱则为可可碱的同分异构体。利用DAD扫描190~400 nm测定并提取各色谱紫外分光色谱(UV)图。结果显示,选择272 nm为检测波长,己酮可可碱、可可碱、茶碱、咖啡因与弱极性的聚合物等合成带来的杂质及货架期的降解产物均可检测。

表2 有关物质含量测定结果(%)

国家药品标准中有关物质检查项下,采用甲醇-水-醋酸(32∶68∶0.5)作为流动相,等度洗脱,记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。对已知有关物质及其余单个有关物质没有明确的规定,只计算总有关物质的量(1.0%)。从样品检测对比结果来看,国家标准检出杂质的个数少,杂质总量只有0.08%。该法有关物质的限度修订为已知杂质可可碱、茶碱与咖啡因按外标法计算。由表2可见,有关物质检查结果均不大于0.2%,其他单个杂质峰面积不大于对照品溶液中己酮可可碱的峰面积(0.2%),杂质总量不过1.0%。

比较了3个不同牌号色谱柱,以柱效、主峰的保留时间、对样品杂质的分离效能等综合指标评价,色谱柱均适用。该法专属性强,己酮可可碱与各杂质峰的分离度均符合要求,可更好的控制产品的质量。该法专属性强、灵敏、准确,可用于注射用己酮可可碱有关物质的测定。

[1]杨丽红.己酮可可碱治疗急性脑梗塞 58例[J].中国药业,2007,16(1):58.

[2]郝 嘉,郭 红,肖颖彬.己酮可可碱的药理特性和临床新用途[J].中国新药与临床杂志,2002,21(3):183-186.

[3]张词侠,张桂林,李志勇,等.己酮可可碱的药理特性和治疗用途的研究进展[J].中国临床药理学杂志,2008(1):74-77.

[4]WS1-(X-106)-2005-2006Z.国家药品标准[S].

[5]尹德忠,吴耀国,赵红侠.注射用己酮可可碱中己酮可可碱含量及有关物质的高效液相色谱法测定 [J].分析仪器,2007(4):54-57.

Determination of Related Substances in Pentoxifylline for Injection by HPLC

Du Biying
(Guangzhou Institute for Drug Control,Guangzhou,Guangdong,China 510160)

Objective To establish an HPLC gradient elution method for the determination of related substances in pentoxifylline for injection.M ethods Agilent Zorbax Eclipse plus C8column (250 mm×4.6 mm,5 μm)was used,the methanol-0.544% solution of potassium dihydrogen phosphate(3∶7)as mobile phase A,and a mixture of methanol-0.544% solution of potassium dihydrogen phosphate-(7∶3)as mobile phase B.The detection wavelength was 272 nm and the flow rate 1.0 mL/min for the gradient elute.Results Pentoxifylline and its related substances can be separated effectively by this method.The concentration-response relationship was linear over the range of 0.4-5.0 μg/mL and the limit of detection were 8.5,11.1,28.8,12.6 ng.Conclusion The HPLC method is specific,accurate and sensitive which may be used for the inspection of related substances in pentoxifylline for injection.

Pentoxifylline for Injection;related substances;HPLC

R927.2;R972+.4

A

1006-4931(2015)21-0123-03

杜碧莹,硕士研究生,副主任药师,研究方向为化学药品检验,(电子信箱)winddby@tom.com。

2014-11-13;

2015-04-24)

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